蓝细菌CRISPRa系统的开发及其代谢工程应用

蓝细菌是光合作用研究的模式生物之一,也是构建光能自养细胞工厂的良好底盘。然而目前蓝细菌的遗传操作工具仍然较为缺乏且效率较低,开发高效的蓝细菌基因调控工具对于蓝细菌系统与合成生物学研究具有重要意义。本研究在模式蓝细菌聚球藻PCC 7942中开发了CRISPR激活系统,测试了多个转录激活因子,将内源的RNA聚合酶ω-亚基RpoZ与无DNA切割活性的dCas9融合表达,利用高强度启动子表达向导RNA,进而敲除内源rpoZ基因并优化了dCas9-RpoZ的表达及靶向位点。利用建立的CRISPRa系统对重要生物燃料——异戊烯醇的生物合成途径进行了工程改造,该系统不仅能够实现单基因或多基因的高表达,还可以同时对不同基因进行转录激活和抑制,将蓝细菌中异戊烯醇的产量提高了17倍,展示了该系统有望成为构建光能自养细胞工厂的有力工具。

强酸型离子交换膜催化合成丙酸异戊酯

以 HF-1 0 1型强酸型离子交换膜为催化剂 ,对丙酸与异戊醇的酯化反应进行了研究。考察了反应时间、催化剂用量、酸醇摩尔比及催化剂的套用次数对酯化率的影响。探讨其最佳反应条件为 :酸醇摩尔比 1∶ 1 .3 ,反应时间 90 min,催化剂用量为反应物总质量的 6.5 % ,反应温度为回流温度 ,酯化率 98%。催化剂套用 8次后酯化率仍在 80

氯代异戊烯水解工艺的研究

对含氯代异戊烯原料水解工艺进行了研究。在以氢氧化钠水溶液进行氯代异戊烯水解时发现,水解产物为异戊烯醇和甲基丁烯醇的混合物,这说明氯代异戊烯在进行取代反应的同时,伴有正碳离子的异构化反应,由此开发了一条全新的由氯代异戊烯生产甲基丁烯醇和异戊烯醇的新的工艺路线。水解反应较理想的工艺条件为:在氯代异戊烯投料量为100 g,原料滴加速率为4 g／min,NaOH用量为38 g,水用量为150 g,反应时间为70-80 min,反应温度为70～80℃和搅拌速率为500 r／min时,水解转化率可以达到99％以上,选择性则在94％以上。

异戊烯醇的合成工艺研究

以异戊二烯为原料直接水合法制备异戊烯醇的工艺,考查了不同溶剂、原料配比、催化剂用量及反应时间对反应的影响。

异戊烯醇中微量有机氯的去除工艺研究

异戊烯醇粗品用氢氧化钠脱除其中的微量有机氯。研究了反应温度、碱液浓度、搅拌速度及反应时间对有机氯去除率的影响。结果表明,采用压力反应器,充分搅拌混合,温度控制在130℃以上,反应8 h,有机氯去除率达到97.0%。

引入新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的合成

目的:微生物体内异戊二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控,因此限制了异戊二烯类化合物的高效生物合成,而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径,通过在微生物中引入IUP能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成,从而促进异戊二烯类化合物的大量合成。方法:在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP,强化异戊烯焦磷酸酯生物合成,促进β-胡萝卜素的高效积累。结果:通过生物信息学的方法预测IUP中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶Sc CK和拟南芥来源的异戊烯磷酸激酶At IPK,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,二者都具有疏松不稳定的结构特征,显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源β-胡萝卜素合成关键基因carRP和car B,强化甲羟戊酸途径的关键基因thmgR和ggs1,使工程菌株中积累2.68 mg/Lβ-胡萝卜素。通过Cre-loxP系统回收基因组上的ura标签,再将IUP进一步整合到工程菌株染色体上。当培养基中含有20 m M异戊二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后,重组解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L,较原始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IUP能够促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的高效积累,为利用IUP开展β-胡萝卜素和其他异戊二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。