九龙牦牛肌细胞生成素基因的克隆及其表达谱

旨在获得九龙牦牛(Bos grunniens)肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱和时序表达谱,为进一步研究九龙牦牛肌肉发育和肉质形成奠定基础。本试验通过RT-PCR技术克隆九龙牦牛MyoG基因,利用半定量RT-PCR技术检测该基因在九龙牦牛不同组织中的表达情况,利用荧光定量PCR技术检测该基因在九龙牦牛不同发育时期背最长肌的表达情况。结果表明,获得九龙牦牛700bp的MyoG基因序列(GenBank登录号:KC184120),其中ORF为675bp,编码224个氨基酸,与普通牛、人、小鼠、大鼠、猪、羊和兔MyoG氨基酸序列同源性为92%~99%;MyoG基因仅在背最长肌中检测到表达,在心、肝、脾、肾和脂肪中未检测到表达;MyoG基因随着九龙牦牛年龄段增长表达呈上升趋势,且在3.5~5.5和9岁以上的牛肌背最长肌中的表达显著高于0.5岁牛的表达水平(P【0.05)。结果表明,MyoG基因可能在九龙牦牛肌肉组织发育过程中发挥重要的调控作用。

九龙牦牛不同部位肉中脂肪酸组成分析评价

脂肪酸对肉品质有着重要作用。本研究中通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对不同部位九龙牦牛肉脂肪酸种类、含量进行测定,以对颈脖肉、上脑、外脊、牛霖不同部位肉进行评价。研究结果表明:饱和脂肪酸相对含量最高的是上脑,最低的是牛霖,且两者差异显著(p<0.05);不饱和脂肪酸相对含量最高的是牛霖,最低的是颈脖肉,两者差异显著(p<0.05)。多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值作为评价肉品质的重要指标,在外脊与牛霖上反应不同,差异达到显著水平(p<0.05),而颈脖肉和上脑之间差异不显著(p>0.05)。除了颈脖肉,其它3个部位在n-6与n-3比值上差异不显著(p>0.05)。根据分析结果,旨在从营养学角度评价不同部位肉品质,并对指导生产实践、延长货架期提供科学依据。

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析.结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型.在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率.麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大.

九龙牦牛CAST基因部分序列的克隆及其表达差异研究

根据牛钙蛋白酶抑制蛋白((Calpastatin,CAST)设计并合成一对引物,从九龙牦牛肌肉组织提取总RNA,利用RT-PCR扩增获得九龙牦牛CAST基因部分片段,利用SQRT-PCR技术检测九龙牦牛各组织中CASTmRNA的表达差异.结果,成功克隆九龙牦牛CAST部分cDNA序列485bp,获得GenBank登录号为FJ483833;用DNAman软件分析发现九龙牦牛CAST基因与普通牛的核苷酸同源性依次为99%;SQRT-PCR组织表达检测表明,CAST基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪中均表达,在心脏中表达最高,在脂肪组织中表达最低.

麦洼牦牛和九龙牦牛乳蛋白遗传多态性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳蛋白多态性进行分型,并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性。结果表明:β CN、κ CN和α La呈单态,基因型分别为AA、BB和BB型;而αs1 CN和β Lg呈多态,αs1 CND基因为优势基因,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.8073和0.6000,β Lg座位优势基因为β LgE,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.9770和0.9700;麦洼牦牛和九龙牦牛群体平均杂合度分别为0.1021和0.1867;在2个品种牦牛群体中,除αs1 CN基因座对九龙牦牛乳脂率有显著影响外,其余乳蛋白基因座对泌乳性能及乳蛋白相对百分含量均无显著影响。

九龙牦牛H-FABP与ADD1基因的表达谱研究

为了研究心脏型脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid—binding protein，H—FABP）与脂肪细胞决定和分化因子1（Adipocyte determination and differentiation factor-1，ADD1）在九龙牦牛肉质形成中的作用，试验以九龙牦牛为研究对象，利用半定量RT—PCR检测其在九龙牦牛不同组织和不同发育阶段的表达差异，获得其组织表达和时序表达谱。结果表明：检测到H—FABP基因在九龙牦牛的心脏、脾脏、背最长肌和脂肪组织中表达，在肝脏和肾脏中未表达；ADDl基因仅在九龙牦牛的背最长肌和脂肪中表达，在心脏、肝脏、脾脏和肾脏中均未表达。时序表达谱分析结果显示，H—FABP与ADD1基因在0．5岁牦牛背最长肌中的表达丰度显著高于3．5～5．5岁和9岁以上的牦牛（P〈0．05），3．5—5．5岁牦牛背最长肌中的表达丰度显著高于9岁以上的牦牛。

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析。结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型。在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大。

九龙牦牛C带和银染核仁组织区（Ag－NORs）的研究

对九龙耗牛染色体的核型、Ｃ带及Ａｇ－ＮＯＲｓ的研究表明：九龙耗牛的常染色体为近端着丝粒染色体，Ｘ、Ｙ染色体为亚中部着丝染色体，Ｃ带具有多态性，Ａｇ－ＮＯＲｓ分布于２、３、４、５、２８对染色体上，其频率为５．０４；并对耗牛常染色体的形态和犏牛雄性不育的机理进行了讨论，为九龙耗牛的研究提供了细胞遗传学方面的资料。

九龙牦牛产肉性能的研究(二报)

九龙牦牛产肉性能和肉质特性研究是九龙牦牛种质特性测定的重要内容。1989年10月在九龙县斜卡乡对九龙牦牛斜卡类系的2.5岁公牛、4.5岁公牛和阉牛及洪坝类系的4.5岁阉牛的胴体性能进行了测定,对肉样的化学成分进行了分析,同时测定了肉样的氨基酸含量。试验中还对肌肉 PH,系水率,肉的贮存损失和烹调损失,脂肪的熔点和碘价等肉质特性进行了测定和研究。结果表明九龙牦牛表现出良好的产肉性能。为九龙牦牛的选育和牦牛肉质特性研究提供了重要的科学依据。

九龙牦牛肉质特性的研究

肉质特性是具有重要经济意义和涉及多学科领域的课题。牦牛肉质特性的客观评定和研究尚存空白。在1988—1991年共对两个类系不同性别和年龄38头九龙牦牛的肉质特性进行了较系统日测试和研究,对供试牦牛的肌肉 pH 值、系水率、肉的贮存损失、熟肉率和烹调损失率及肉色等进行了研究和评定,分析了不同部位肌肉的化学成分,氨基酸及微量元素含量,测定了脂肪的熔点、碘价及皂化价,结果表明牦牛肉系水力强,肉的贮存损失及烹调损失较小,肉色深红。牦牛肉具蛋白质含量高,脂肪含量低及富含各种氨基酸的特点。表明牦牛肉鲜美可口是名符其实的无污染的天然优质肉食品。本研究是九龙牦牛种质特性测定的一部分,将为开展九龙牦牛选育,加快牦牛肉品资源开发利用提供重要科学依据和参数。

九龙牦牛引进到青海大通和甘南地区的适应性观测

１９８８年４～５月对引进到青海大通牛场和甘南藏族自治州的九龙牦牛的适应性、生长发育、生产性能与行为表现等进行了调查、观察和测定，并对其生理指标进行了测定，结果表明，在青海高原的生态条件下，九龙牦牛是适应的，生长发育良好，并表现出良好的产毛绒性能。

九龙牦牛产毛性能的研究

为了有计划地开展九龙牦牛毛绒的开发和利用，连续五年对九龙牦牛产毛性能进行了系统的测试和分析，结果表明：幼龄母牦牛剪毛量为１．２５ｋｇ～１．５１ｋｇ，３岁以上母牦牛剪毛量具有随年龄增长而下降的趋势．公牦牛剪毛量为１．２７ｋｇ～４．３１ｋｇ，存在随年龄增长而增高的趋势，直到６岁以上剪毛量趋于稳定．幼龄牦牛含绒率显著高于成年牦牛（Ｐ＜０．０１），净毛率为８０．４３％～９４．７９％．两类系（斜卡和洪坝）间产毛性能无显著差异（Ｐ＞０．０５）．与其它牦牛品种研究结果比较，表明九龙牦牛具有产毛量高。

九龙牦牛高分辨G带带型的研究

采用氨甲喋呤阻断法使细胞分裂同步化，并结合胰酶Ｇ显带技术，研究了九龙牦牛的高分辨Ｇ带核型。将牦牛显带染色体划分为１０８个区，并绘制了Ｇ带模式图。

九龙牦牛AQP7基因鉴定及在各组织中的表达和定位

为鉴定牦牛水通道蛋白7(AQP7)基因,分析其在不同组织中的表达水平及蛋白定位,采用RT-PCR方法克隆九龙牦牛AQP7基因,并进行生物信息学分析,采用RT-qPCR方法检测AQP7基因在九龙牦牛8种不同组织中的表达量,并用免疫组织化学染色方法对AQP7蛋白进行组织表达及定位分析。结果表明,九龙牦牛AQP7基因CDS区序列长度为993 bp,编码330个氨基酸,生物信息学分析发现,AQP7为稳定的疏水性蛋白。进化树结果显示,九龙牦牛AQP7基因与黄牛的亲缘关系最近,同源性为99.7%。AQP7基因在九龙牦牛心脏和肌肉表达量较高,极显著高于肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃(P<0.01)。免疫组化结果显示,AQP7蛋白主要分布在九龙牦牛心脏和肌肉的肌细胞以及肾脏近曲小管中,且在心脏、肌肉和肾脏中的表达显著高于肝脏、脾脏、肺脏、小肠和瘤胃(P<0.05)。结果为深入研究AQP7基因在牦牛低氧适应性中的生理功能和能量代谢机制提供了基础数据。

九龙牦牛高分辨G带带型的研究

采用氨甲喋吟阻断法使细胞分裂同步化,并结合胰酶 G 显带技术,研究了九龙牦牛的高分辨 G 带核型。将九龙牦牛显带染色体划分为108个区。

九龙牦牛和麦洼牦牛血清酯酶、淀粉酶同工酶遗传特性及其与生产性能相关的研究

采用非连续性缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分别对50头九龙牦牛和50头麦洼牦牛的血清酯酶(ES)同工酶、淀粉酶(Am)同工酶进行了研究。在ES同工酶的研究中,九龙牦牛5带较多,占43.9％,麦洼牦牛6带较多,占54.7％;九龙牦牛的带型座含有Es—5,而麦洼牦牛有Es—8,却无Es—5;Am基因座均受Am^A、Am^B、Am^C三个等显性等位基因控制,两个品种都未出现AA和AB型,且Am^c基因频率是两个品种的优势基因;麦洼牦牛的杂合子频率(0.867)高于九龙牦牛(0.780)。表明麦洼牦牛的遗传特性比九龙牦牛复杂。对麦洼牦牛的两个同工酶的活力与产奶量、乳脂率以及体重的关系作了相关分析,结果表明ES同工酶的强带与产奶量、乳脂率呈显著正相关、与体重呈显著负相关。Am同工酶的总活力与产奶量、乳脂率呈显著的负相关、与体重呈显著正相关。这不仅表明了ES同工酶、Am同工酶与生产性能具有较密切关系,而且对开展选育工作及牦牛生产性能鉴定等方面有重要意义。

九龙牦牛冷季补饲试验

[目的]为了提高冷季补饲效果。[方法]本试验选择1~15岁的60头九龙牦牛作为试验组,同龄50头牦牛作为对照组,试验组采用白天放牧＋晚上补饲配制精料的方式开展补饲试验,对照组只开展放牧,不补饲。试验开始时及开始后30 d和90 d分别测量体尺和体重。[结果]表明：在试验不同阶段,同龄牦牛身高、体斜长和胸围等体尺指标在补饲组和对照组间无显著差异（P〉0.05）,但补饲第90 d,试验组不同年龄牦牛体重均已出现正增长,即体重已超过补饲前的体重;对照组1岁、2岁和5岁牦牛出现正增长,但8、10、12岁母牦牛还没有恢复到补饲前的体重。[结论]说明冷季补饲可以减少九龙牦牛冬季掉膘,加速暖季增长。

九龙牦牛肌肉组织学特性研究(初报)

肌纤维的细度与密度以及肌肉肌纤维与结缔组织之比例,在一定程度上反映了肉的品质。作者于1989年研究了九龙牦牛的斜卡、洪坝两类系14头2.5～6.5岁以上健康牦牛背最长肌的组织学特性,并与其它牛种相同部位肌肉组织进行比较。结果表明,九龙牦牛肌纤维直径为41.94～53.66μ,肌纤维密度为301.6～336.45(N/mm^2),并测定了不同年龄九龙牦牛背最长肌内肌纤维与结缔组织体积比(％)。在一定程度上表明了九龙牦牛的肉质细嫩,品质良好,为九龙牦牛作为肉用型牦牛品种的选育提供了一定的理论依据。

四川九龙县牦牛源蜱感染SFGR分子流行病学调查

为了解四川省九龙县牦牛体表寄生蜱的种类及其斑点热群立克次体(SFGR)的感染情况。采集牦牛体表的蜱,经形态学初步鉴定后,提取蜱总DNA,PCR扩增蜱ITS-2基因及SFGRompA、ompB基因,并对扩得的阳性产物进行测序和构建进化树分析,从而确定蜱及其携带SFGR的种类。在九龙县3个乡镇共采集到蜱585只,其中微小扇头蜱占52.65%(308/585)、卵形硬蜱占32.99%(193/585)、锐跗硬蜱和西藏革蜱分别占8.89%(52/585)和5.50%(32/585)。所有蜱中有374只检出SFGR,总感染率为63.93%(374/585),其中半农牧区(70.60%)的感染率极显著的高于纯牧区(45.10%)(P<0.01)。本研究首次对九龙县牦牛体表寄生的蜱虫种类及SFGR流行情况进行了调查,蜱传SFGR感染率较高且感染的SFGR主要为饶氏立克次体。

九龙公牦牛κ-酪蛋白CSN3基因两个位点的多态性研究

为了研究九龙牦牛κ-酪蛋白CSN3基因中两个位点的遗传多态性,试验采用Chelex 100法从九龙公牦牛(n=100)肌肉中快速提取基因组DNA,用PCR法扩增κ-CN CSN3基因第4外显子部分片段,并利用非变性PAGE和PCR-SSCP法分析扩增序列中存在的多态位点及其关联性。结果表明:九龙公牦牛的CSN3基因具有12 bp重复序列(编码4个氨基酸)多态性,产生3种基因型,即LL、LS和SS,基因型频率分别为0.640,0.280,0.080,且测序发现L等位基因比S等位基因多12 bp重复序列;PCR-SSCP方法可确定CSN3基因第13 064 bp处发生C/T异义突变,表现为不同的基因型,即CC、CT和TT,基因型频率分别为0.680,0.250,0.070。在九龙公牦牛中,CSN3基因中具有12 bp重复序列的L等位基因和编码Thr136的C等位基因占明显优势,说明用非变性PAGE和PCR-SSCP法可精准分析九龙公牦牛CSN3基因型,两个多态性位点在进化上可能有关联。