利拉鲁肽对2型糖尿病性骨质疏松大鼠骨钙素、Hedgehog信号通路及CaBp-D9k基因表达的作用机制

目的 研究利拉鲁肽对2型糖尿病性骨质疏松大鼠骨钙素、人类胚胎发育调控因子(Hedgehog)信号通路及钙调节蛋白(CaBp-D9k)基因表达的作用机制。方法 取60只SD大鼠随机分为健康组、糖尿病组、糖尿病+利拉鲁肽组、去势组、糖尿病+去势组、糖尿病+去势+利拉鲁肽组,每组10只。糖尿病组、糖尿病+利拉鲁肽组、糖尿病+去势组、糖尿病+去势+利拉鲁肽组建立糖尿病模型,去势组建立去势模型,糖尿病+去势组、糖尿病+去势+利拉鲁肽组在糖尿病模型建立成功后建立去势模型。采用全自动化学分析仪检测空腹血糖值,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰岛素水平,HE染色观察病理形态,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素(BGP)mRNA、CaBp-D9k mRNA水平,TUNEL检测成骨细胞凋亡,免疫印迹检测音猬因子(Shh)、细胞表面受体(Ptch)1、锌指蛋白(Gli)1蛋白表达。结果 HE染色结果显示:与健康组相比,糖尿病组和去势组中骨小梁排列紊乱,数量减少,变细,发生断裂,空洞增多,成骨细胞数量显著减少,糖尿病+去势组中这种病理变化更加严重;在经过利拉鲁肽干预后,糖尿病+利拉鲁肽组和糖尿病+去势+利拉鲁肽组新生骨量及成骨细胞增多。与健康组相比,糖尿病组、去势组、糖尿病+去势组空腹血糖值、成骨细胞凋亡指数升高,胰岛素水平、BGP、CaBp-D9k、Shh、Ptch1、Gli1水平降低,且以去势组与糖尿病+去势组水平变化最显著(P<0.05),经过利拉鲁肽干预后,与糖尿病组、去势组及糖尿病+去势组相比,糖尿病+利拉鲁肽组、糖尿病+去势+利拉鲁肽组空腹血糖值、成骨细胞凋亡指数显著降低,胰岛素水平、BGP、CaBp-D9k、Shh、Ptch1、Gli1显著升高(P<0.05)。结论 利拉鲁肽通过激活Hedgehog信号通路、提高骨钙素及CaBp-D9k水平,降低血糖水平,减少成骨细胞凋亡,促进骨形成,改善糖尿病骨质疏松病情严重程度。

基于TCGA和GEPIA数据库分析CENPK基因在前列腺癌中的表达及临床意义

目的探讨着丝粒蛋白K基因(CENPK基因)在前列腺癌中的表达及其临床意义。方法通过下载癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达谱数据交互分析(GEPIA)数据库相关数据,获得498例前列腺癌患者的mRNA表达水平及临床信息,其中52例患者有配对的癌组织与癌旁组织。分析前列腺癌组织中CENPK基因mRNA表达水平,分析不同特征前列腺癌患者CENPK基因mRNA表达水平,比较CENPK基因高表达组与CENPK基因低表达组总体生存时间(OS)及无进展生存期(DFS),基因富集分析明确CENPK基因调控的相关信号通路。结果498例前列腺癌患者的癌组织和癌旁组织中CENPK基因mRNA的表达水平分别为3.9247±1.0929和3.4066±1.1545,差异有统计学意义(t=3.235,P=0.001)。52例配对的前列腺癌组织和癌旁组织中CENPK基因mRNA的表达水平分别为8.2071±0.2952和3.4066±1.1545,差异有统计学意义(t=28.309,P<0.001)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示CENPK基因可作为一个灵敏度和特异度较高的前列腺癌诊断指标(灵敏度为60.8%,特异度为63.5%,曲线下面积为0.625,95%CI为0.785~0.852)。有生化复发、PSA>4 ng/mL、Gleason评分>7分、有肿瘤残留、T分期为T3~T4期、有淋巴结转移的前列腺癌患者CENPK基因mRNA高表达率明显高于无生化复发、PSA≤4 ng/mL、Gleason评分≤7分、无肿瘤残留、T分期为T1~T2b期、无淋巴结转移的前列腺癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。CENPK基因高表达组OS及DFS明显短于CENPK基因低表达组,差异有统计学意义(P=0.045、0.003)。基因富集分析显示,CENPK基因可能通过碱基切除修复、核苷酸切除修复、基因复制、剪接体、错配修复等通路影响前列腺癌的发生、发展。结论CENPK基因在前列腺癌组织中呈高表达,且与临床特征及预后关系密切,可作为前列腺癌较好的诊断标志物。

氧化应激基因表达与k基因结合核因子

氧化应激基因表达与ｋ基因结合核因子周玫，陈瑗（第一军医大学自由基医学研究室，广州５１０５１５）关键词ｋ基团结合核因子，氧化应激，基因表达调控氧化应激在很多疾病的发病机制中起着重要作用，并直接与衰老过程有关。细胞对氧化应激的反应特点是很快地诱导很多基因...

棉铃虫多核型多角体病毒38k基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构的预测

采用半补齐方法建立棉铃虫多核衣壳型多角体病毒基因组文库,通过对插入片段进行克隆鉴定和序列分析,获得了38k基因。该基因上游具有晚期调控保守序列TTAAG,是一个晚期表达基因,基因阅读框为903bp,共编码300个氨基酸,氨基酸序列同源性分析结果表明其与α类杆状病毒的同源性较高,有较近的亲缘关系。氨基酸高级结构的分析表明其与与磷酸酶结构相似性达到95%,与病毒核衣壳的组装有关。

PI3K基因在甲状腺腺瘤组织中的表达及其意义

目的:分析PI3K基因在人甲状腺腺瘤组织与瘤旁组织中mRNA的表达差异,探讨基因PI3K表达与甲状腺腺瘤疾病之间的关系。方法:外科手术中获取19例单发结节型甲状腺腺瘤组织及瘤旁组织,采用RT-PCR技术检测腺瘤及瘤旁组织中PI3K基因的表达水平。结果:甲状腺腺瘤组织中PI3K基因的表达水平为(77.69±14.17)%,瘤旁组织中表达水平为(43.84±18.14)%,甲状腺腺瘤组织中PI3K基因的表达水平显著高于瘤旁组织(P<0.001)。结论:甲状腺腺瘤组织中PI3K基因表达显著上调,PI3K信号转导途径的功能异常可能与甲状腺腺瘤发生发展的机制有关。

棉铃虫多核衣壳型多角体病毒fp25 K基因的克隆及分析

[目的]克隆棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(HearMNPV) fp25 K基因,为深入研究杆状病毒的进化机制提供依据。[方法]通过半补齐法建立HearMNPV的质粒基因组文库,对插入片段进行鉴定和序列分析获取HearMNPV fp25 K基因。[结果]HearMNPV fp25 K基因的读码框由588个核苷酸组成,编码195个氨基酸;该基因上游具有晚期调控保守序列ATAAG,是一个晚期表达基因;HearMNPV fp25 K存在5个α-螺旋,8个β-折叠;HearMNPV与蓓带夜蛾核型多角体一致性最高,达97.0%,与舞毒蛾多核衣壳型多角体的FP’同源性最低,仅为19.3%。HearMNPV与GroupⅠNPVs、GroupⅡNPVs及GVs的fp25K同源基因间氨基酸平均相似性分别为55.6%、69.4%和29.3%,推测其与Ⅱ类NPVs的亲缘关系较近。[结论]该研究为杆状病毒分子进化、生物防治奠定了基础。

基于matK基因的高良姜及其同属混伪品的分子鉴别

目的:建立基于matK基因的高良姜及其同属混伪品的分子鉴别方法。方法:采用通用引物对高良姜样品matK基因进行PCR扩增和双向测序,并从Gen Bank下载10种同属混伪品的matK基因序列。采用Clustal X、MEGA软件进行序列比对分析、计算遗传距离以及构建聚类树。结果:获得的高良姜及其同属混伪品matK基因序列长度为732 bp,变异位点41个。高良姜种内遗传距离为0.000,与混伪品之间的最小遗传距离为0.003。基于matK序列构建的系统发生树显示高良姜样品聚在一起,能直观地与混伪品区分。结论:matK基因可以有效地鉴别高良姜及其同属混伪品。

利用90K基因芯片进行小麦株高QTL分析

为给小麦株高标记辅助选择提供可供选择的分子标记,并进一步对株高QTL进行精细定位及相关基因克隆,以小麦骨干亲本周8425B和小偃81衍生的包含102个家系的RIL群体(F_8)为材料,利用90K芯片标记构建高密度遗传图谱,在3个环境下对株高进行QTL检测。结果表明,所构建的图谱含有9 290个SNP标记,覆盖了小麦21条染色体的63个连锁群,图谱总长3 894.64cM,平均标记密度为0.42cM。共检测到9个控制株高的QTL,分布于1B、4A、4D、6B、7A、7B和7D染色体上,变异解释率为2.23%~16.25%。QPh.nafu.4D、QPh.nafu.4A、QPh.nafu.1B-2与前人定位到的位置相同或相近。QPh.nafu.7A具有较大的LOD值(8.17)和变异解释率(14.69%),为主效QTL。QPh.nafu.6B、QPh.nafu.7B-1、QPh.nafu.7B-2均能在多个环境下使用多种QTL检测方法定位到,可能为新的较稳定的控制株高的QTL。

钙结合蛋白D-9K基因原核表达载体的构建、表达产物纯化及其多克隆抗体的制备

本研究构建了pBV220/CabpD-9k-βhCG表达质粒,在大肠杆菌TG-1中进行表达,得到了CabpD-9k-βhCG融合蛋白。SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为34.5KD。West-ern blot结果表明,融合蛋白与兔抗人hCGIgG特异结合。用纯化的融合蛋白免疫C57BL小鼠,制备了多克隆抗体,这为进一步研究钙结 合蛋白D-9k在着床中的功能和子宫内膜Ca^(2+)信号转导奠定了基础。

水曲柳S6K基因的生物信息学及胁迫和激素下的表达分析

以所获取的水曲柳FmS6K基因(FmS6K1和FmS6K2)为对象,解析其核苷酸序列及其所编码蛋白质的基本信息,探索非生物胁迫和植物激素条件下基因的表达特征。结果表明,FmS6K1和FmS6K2基因长度分别为1 583和1 796 bp,分别编码480和483个氨基酸,二者均含有完整的开放阅读框。FmS6K1为两性蛋白,FmS6K2是亲水蛋白,二者均不含有信号肽。低温(4℃)和盐(NaCl)胁迫均影响FmS6K1和FmS6K2基因的表达,水曲柳根、茎、叶中的FmS6K1和FmS6K2基因对盐更加敏感,FmS6K2基因比FmS6K1基因对低温和盐胁迫的响应更为敏感;外源ABA、GA和IAA均能够影响FmS6K1和FmS6K2基因的表达,FmS6K1在水曲柳根、茎、叶中对外源的IAA响应更大;水曲柳根茎叶中FmS6K2基因均对外源ABA处理有显著上调应答,对外源GA的响应主要在根中,但对IAA的应答主要在茎和叶片中。上述结果表明FmS6K基因在调控植物生长发育和适应逆境胁迫方面扮演重要角色。

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。

针对非洲猪瘟病毒K205R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验分析显示,本文建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品在1×10^(11)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-2.797,检测下限为10^(2)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.53774%,重复性好。本方法适用于临床样品及本实验室构建的表达ASFV K205R基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对ASFV快速检测及ASF早期诊断有重要意义。

蓖麻PIP5K2基因克隆及功能预测

在植物中,磷脂酰肌醇4,5-二磷PIP5K基因家族中的PIP5K2基因在调控植物生长中起到了关键作用,为探明PIP5K2基因在蓖麻中的作用,以蓖麻PIP5K2基因为研究对象,对该基因进行基因克隆、生物信息学及表达分析。结果表明,以蓖麻cDNA为模板,通过PCR获得了长度为2136 bp的基因片段;通过对该基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析,确定该PIP5K2基因编码的蛋白氨基酸的个数为672,pI值为6.74,其分子质量为76.47 ku,平均亲水性系数为-0.636,是一种亲水蛋白质,其二级结构包括α螺旋、β转角、延伸链、无规卷曲;由预测结果可知,PIP5K2蛋白的三级结构与二级结构是一致的且与麻风树同源性很高。PIP5K2基因在单雌、标雌和两性系3种花序类型的五叶期时的相对表达量都普遍高,在主茎穗开花期相对表达量都普遍偏低;在标雌花序五叶期时有最高相对表达量,在两性花序的主茎穗开花期有最低相对表达量,最高相对表达量是最低相对表达量的80倍左右;在3种花序类型之间,PIP5K2基因在四叶期的相对表达量相似,但相较于单个花序类型植株的不同生长时期,PIP5K2基因在四叶期时的表达量要明显高于开花期。根据该结果推测,PIP5K2基因可能调控蓖麻植株中期的生长,与植株的矮化存在一定的相关性。

香猪MAP3K4基因结构变异多态性和基因表达研究

基于前期比较基因组学分析,在香猪的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4,MAP 3K4)基因第15内含子中发现一个189 bp的结构变异(MAP3K4-I15-sv189)。为探究该结构变异(structural variation,SV)在香猪群体中的多态性分布及其对基因表达的影响,本研究设计一对特异性引物,建立MAP 3K4基因SV的PCR检测技术,分析香猪群体中该结构变异的基因类型;采用RT-qPCR研究结构变异不同基因型之间基因的差异表达。结果显示,香猪群体中MAP3K4-I15-sv189位点存在两种基因型,DD型和ID型(D为缺失基因,I与参考基因一致),其中D等位基因的频率为97.35%;大白猪群体中检测到3种基因型,DD型、ID型和II型,D等位基因频率为80%。相比之下,香猪的D等位基因频率显著高于大白猪的相应值(P<0.05)。采用生物信息学方法分析结构变异区域得到多种剪接元件和重复元件,可能影响MAP 3K4基因的表达。比较香猪各组织中MAP 3K4基因的表达量,发现该基因在肺组织的表达量最高。进一步检测肺组织中3种结构变异类型的相对表达量,显示:DD型>ID型>II型,表明SV的缺失可能促进MAP 3K4基因的表达。本研究表明,香猪MAP 3K4的结构变异MAP3K4-I15-sv189以缺失型为主,缺失型可促进肺组织MAP 3K4基因的表达。研究结果有助于解析香猪易感肺部疾病的分子机制。

MAP2K1基因突变所致心-面-皮肤综合征3一例

心-面-皮肤综合征3(CFC3)属于常染色体遗传病,临床表现为特殊面容、毛发稀疏、心血管系统疾病、喂养困难、全面发育迟缓等多发异常。本文报道1例CFC3病例,患者为9个月大男性婴儿,系巨大胎儿、贯通掌,存在明显的行为异常,患儿出生3个月内生长速度正常,出生3.5个月后骤然下降并出现停滞。本课题组采用全外显子组测序、和基因组拷贝数变异(CNV)分析先证者及其父母外周血DNA发现,先证者MAP2K1(NM_002755)基因的3号外显子存在新发突变c.389A>G(p.Tyr130Cys),并采用Sanger测序对该突变进行验证。根据美国医学遗传学会基因组协会(ACMG)致病性评级该突变为致病性变异。该病例的发现丰富了由MAP2K1基因突变所致CFC3综合征表型特征。

2018年广西壮族自治区防城港市流行性腮腺炎疫情K基因型病毒SH基因特征

目的分析2018年广西壮族自治区防城港市流行性腮腺炎(流腮)疫情中K基因型腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV)分离株的SH基因特征。方法从2018年防城港市小学流腮疫情中采集病例血清和口腔拭子,分别采用酶联免疫吸附试验和实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测MuV IgM/IgG抗体和核酸,对阳性核酸样本的SH基因进行扩增和测序,分析其基因特征。结果在采集样本的流腮病例中,MuV IgM、IgG抗体阳性率分别为68.2%(15/22)、100%(22/22),MuV核酸阳性率为80.8%(21/26)。选取10株MuV进行SH基因核苷酸序列分析,经鉴定均为K基因型,核苷酸同源性为99.6%-100%;其与2016年中国广西和越南K基因型株、中国S79疫苗株的核苷酸同源性分别为99.0%-99.6%、84.4%-84.8%。MuV分离株的某些氨基酸位点发生了突变。结论2018年广西防城港市流腮疫情为K基因型MuV引起;与越南K基因型MuV亲缘关系密切。需加强中越边境地区含腮腺炎成分疫苗接种和流腮监测处置工作。

基于40K基因芯片的326份水稻品种遗传多样性与重要病虫抗性基因鉴定

为明确华南稻作区水稻品种的遗传多样性和褐飞虱、稻瘟病及白叶枯病抗性基因的分布,本研究利用32887个SNP标记对326份水稻品种进行遗传多样性分析,并检测20个褐飞虱、稻瘟病及白叶枯病抗性位点。聚类分析结果表明,当遗传距离为0.4210时,326份水稻材料可分为4个群体(Ⅰ~Ⅳ),类群Ⅳ包含249个水稻材料,又可分为4个亚群。利用水稻12条染色体上SNP标记进行品种间两两比较分析,发现有18对品种间无差异位点,25对材料间差异SNP少于300个。检测Bph6、Bph9、Bph14、Bph15、Bph18、Bph26、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pia、Pid2、Pid3、Pigm、Pita、xa5、Xa7、xa13、Xa21和Xa23在326份材料中的分布情况,结果表明,大部分华南稻作区水稻品种携带稻瘟病抗性基因Pi5(48.2%)、Pia(59.8%)、Pid2(65.9%)、Pid3(82.8%)和Pita(48.2%);主要应用的白叶枯病抗性基因为Xa21;但仅有5.2%的品种含有褐飞虱抗性基因。本研究结果为华南稻作区水稻培育多样化品种和抗性育种提供科学依据。

腺病毒过表达TNNI3K基因对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度的影响

目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad.GFP病毒和Ad.TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。

脑组织特异表达钙结合蛋白D-28k转基因小鼠的制备

小鼠精子经2%DMSO处理与酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经细胞内特异表达钙结合蛋白D-28k(CaBP)的构件pTH-CB孵育,PCR筛选体外受精移植出生的仔鼠后代,通过测定黑质致密部、腹侧被盖区、大脑皮层和海马CaBP表达量以及黑质致密部CaBP阳性细胞数验证转基因鼠calbindin D-28k表达。结果表明:获得2只在脑内TH阳性神经细胞内特异性表达calbindin D-28k且稳定遗传目的基因原代鼠,表达CaBP具有抗MPTP诱导的神经细胞损伤功能。结果说明脑组织特异性表达calbindin D-28k转基因鼠谱系建立。

H-2K^b基因导入小鼠造血细胞的研究

本研究应用分子克隆技术，用脂质体（lipofectin）将MHC－Ⅰ类基因（即小鼠H－2kb基因）导入包装细胞PA317。用培养的病毒上清进一步感染BALB／C小鼠的造血细胞，且形成了抗G418的CFU－GM。通过多聚酶链式反应（PCB）和反转录-多聚酶链式反应（RT－PCR），表明病毒上清感染后的小鼠造血细胞及其形成的CFU－GM中均整合了MHC-Ⅰ类基因，且已转录为mRNA。流式细胞仪（FACS）测定结果表明，感染后的小鼠造血细胞及其形成的CFU－GM中均有MHC－Ⅰ类抗原的表达。本实验结果表明MHC－Ⅰ类基因已成功地导入小鼠造血细胞中，且不影响其增殖和分化能力。