非洲猪瘟病毒K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选与鉴定

【目的】利用噬菌体展示技术筛选非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R蛋白的特异性纳米抗体。【方法】将原核表达、纯化的ASFV K205R蛋白免疫双峰驼,采集全血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA并反转录,巢式PCR扩增VHH基因,构建VHH噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选K205R特异性纳米抗体。【结果】成功构建库容量为5×10^(8)的VHH噬菌体文库,然后利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,特异性VHH噬菌体得到明显富集,氨基酸序列比对显示共筛选出5株K205R蛋白的特异性纳米抗体,分别为ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb14、ASFV-K205R-Nb35、ASFV-K205R-Nb64和ASFV-K205R-Nb82。【结论】筛选的5株纳米抗体均具有良好的特异性,其中ASFV-K205R-Nb1、ASFV-K205R-Nb35和ASFV-K205R-Nb82具有更好的亲和力,为以纳米抗体作为灵敏探针建立的特异性强、灵敏度高、成本低的新型ASFV血清学诊断方法提供依据。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白重组腺病毒载体的构建及小鼠免疫效力评价

为了研制安全有效的非洲猪瘟(ASF)疫苗,本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV) Georgia 2007/1株基因组序列合成ASFV K205R基因,通过同源重组技术构建重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,使用Western blot检测K205R非结构蛋白的表达情况,PCR检测其遗传稳定性,腺病毒滴度检测试剂盒测定其滴度。使用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清K205R特异性抗体,采用多因子检测试剂盒测定血清中IFN-γ和IL-4细胞因子含量,采用CCK8法检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示,成功包装出重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,能够正确表达K205R融合蛋白;接种293T细胞并连续传代20代,均可稳定遗传,病毒滴度可达9.5×1010PFU/mL;ELISA结果显示,小鼠一免后7~21 d可检测到K205R特异性抗体,并在二免后14 d内产生更高的抗体水平;K205R蛋白能显著刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4,同时也能显著刺激脾脏淋巴细胞增殖(P<0.05)。结果表明,Ad5-ASFV-K205R重组腺病毒免疫小鼠能诱导机体的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有很好的应用潜能,为进一步研发ASF疫苗提供基础。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白的原核表达与单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R蛋白。将纯化出的蛋白乳化后免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选出来的单克隆细胞注射至小鼠腹腔中,待小鼠腹部膨大时收集腹水,通过ELISA方法鉴定腹水效价、Western blot和IFA鉴定单克隆抗体特异性及反应原性,并对单克隆抗体亚型进行鉴定。经SDS-PAGE鉴定,重组ASFV K205R蛋白成功表达。Western blot分析显示,His标签抗体能够特异性识别重组表达的ASFV K205R蛋白,表明其具有良好的特异性以及反应原性。通过细胞融合和细胞筛选得到1株能稳定分泌抗ASFV K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1C3G6。ELISA检测腹水中抗体效价为1∶100000。Western blot和IFA鉴定结果显示单克隆抗体1C3G6与K205R蛋白反应性良好。通过亚型鉴定,单克隆抗体1C3G6的重链为IgG2b类,轻链为Kappa型。经Western blot和IFA鉴定,筛选得到的1C3G6单克隆抗体可以特异性识别原核系统和真核系统表达的K205R蛋白,说明该抗体具有良好的特异性。

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白基因原核表达的研究

本研究合成非洲猪瘟的K205R基因,将K205R基因克隆至pET-30c(+)质粒,构建重组原核表达质粒pET30C-K205R。该重组质粒的阅读框架正确,表达的融合蛋白的N端和C端均带6×组氨酸。pET30C-K205R-BL21菌株经培养和诱导表达后,可生产K205R可溶性蛋白,K205R可溶性蛋白可用Ni柱纯化。纯化表达K205R蛋白的ELISA试验证明,表达的K205R蛋白与猪阳性非洲猪瘟血清具有较好的特异性反应。

非洲猪瘟病毒无标签重组K205R抗原制备与应用

为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%;TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D450nm值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性,24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。

非洲猪瘟K205R蛋白的原核表达及多抗的制备

为了表达非洲猪瘟K205R蛋白,进而制备其多克隆抗体,为非洲猪瘟血清学检测方法的建立奠定基础。以合成的K205R基因为模板,PCR扩增该基因序列,并将其克隆至原核表达载体p ET-21a中,得到重组质粒p ET-21a-ASFV-K205R。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达His-ASFV-K205R融合蛋白,通过亲和层析的方法纯化His-ASFV-K205R融合蛋白。通过Western Blot方法鉴定融合蛋白的抗原性,以此融合蛋白为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过ELISA的方法测定多抗效价。结果表明,原核表达的K205R蛋白具有很好的抗原性,制备的兔多克隆抗体效价为1∶128 000,为建立非洲猪瘟的血清学检测方法提供生物材料。

牙林线k205路基下沉病害研究与整治

一、病害概况牙林线K 205+380～+465为典型的路基下沉病害地段,海拔约800米,地形为左侧环山,右侧邻河,地面生长塔头草,线路呈南北走向,延展在河谷地带的一级阶地上。该段线路自1958年运营以来状态较好,但从1972年以后年年发生下沉病害,起初下沉量较小,随之逐年加深。特别是1980年以后,下沉病害更为突出。计1981年下沉0.41米,1982年下沉0.59米、1983年下沉0.67米、1984年下沉0.88米、1985年下沉0.98米、1986年下沉竟达1.21米。由于下沉严重,排水不良,造成路基两侧地面下凹,常年积水,特别是左侧更为严重。下沉后地面形成一个约100平方米的热融湖塘,水深约1.5米,路基常年被水浸泡,路堤及两侧下沉也越来越明显。为了保证行车,养路工区采取卸碎石然后再起道的方法维持行车。夏季每隔三、四天起道一次,雨后有时每隔一天要起道一次。1987年6月8日～9月30日共维修30余次,起道量累计1360多毫米。几年来该段线路耗费了大量维修人工和材料。

针对非洲猪瘟病毒K205R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验分析显示,本文建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品在1×10^(11)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-2.797,检测下限为10^(2)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.53774%,重复性好。本方法适用于临床样品及本实验室构建的表达ASFV K205R基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对ASFV快速检测及ASF早期诊断有重要意义。

类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化

为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入pET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达pET-28a-K205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为IgG1型;单抗的腹水效价分别为1∶51200、1∶409600和1∶102400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)K205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,建立基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法。对在猪肝脏组织DNA中掺入重组质粒制备的模拟样品进行扩增来确定所建方法的实际检测效率,并将OIE推荐的基于p72的qPCR调整后作为评价该方法检测效果的对照。试验结果表明,基于K205R基因的检测方法在检测模拟样品时扩增效率要优于基于p72的方法,而且敏感性和特异性强,适用于非洲猪瘟的快速检测、监测。