Bcl-2腺病毒/E1B 19kD相互作用蛋白3对弥漫性轴索损伤后少突胶质细胞凋亡的调控作用

目的探讨Bcl-2腺病毒/E1B 19kD相互作用蛋白3(BNIP3)对大鼠弥漫性轴索损伤(DAI)后少突胶质细胞凋亡的调控作用。方法 77只SD雄性成年大鼠随机分为假手术组(11只)、DAI组(33只)及干预组(33只)。参照Marmarou方法制做DAI模型,干预组大鼠在打击后立即给予脑室注射BNIP3抑制剂necrostatin-1 (Nec-1,30 g/L,2μl),检测Nec-1干预前后DAI大鼠BNIP3蛋白表达,少突胶质细胞凋亡以及髓鞘的组织病理学变化。结果与假手术组相比,大鼠DAI损伤后脑干组织BNIP3表达上调,且与细胞凋亡成正相关;Nec-1干预有效降低DAI大鼠少突胶质细胞BNIP3蛋白表达,显著减少DAI大鼠少突胶质细胞凋亡的数目,提高DAI大鼠脑干髓鞘劳克坚牢蓝(LFB)染色平均吸光度和髓鞘碱性蛋白(MBP)表达,改善DAI大鼠脑干髓鞘的超微结构。结论 BNIP3参与DAI诱导的少突胶质细胞凋亡,抑制BNIP3可保护DAI大鼠少突胶质细胞和髓鞘。

抗纤益心方对呋喃唑酮诱导的扩张型心肌病大鼠模型心肌组织中腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3表达的影响

目的:探讨抗纤益心方对呋喃唑酮诱导的扩张型心肌病(DCM)大鼠模型心肌组织中腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(BNIP3)表达的影响。方法:将造模成功的30只Wistar雄性大鼠随机分为模型组、抗纤益心方组、曲美他嗪组,另取10只正常大鼠作为空白组,抗纤益心方组、曲美他嗪组分别给予抗纤益心方(1.8 g/kg·d)、曲美他嗪(6.25 mg/kg·d)灌胃,空白组及模型组灌胃等体积生理盐水。连续给药8周后,动物超声仪检测各组大鼠心功能,Western blot检测各组大鼠心肌组织中BNIP3表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠心功能明显降低,心室变大,室壁变薄,心肌组织中BNIP3表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比,抗纤益心方组、曲美他嗪组大鼠心室缩小,室壁较厚,心功能增强,心肌组织中BNIP3表达水平显著升高(P<0.05)。结论:抗纤益心方可能通过上调BNIP3的表达发挥对DCM大鼠的心脏保护作用。

Bcl-2/腺病E1B 19kD蛋白相互作用蛋白3类似物对PC12细胞线粒体自噬的作用

目的探讨Bcl-2腺病E1B 19kD蛋白相互作用蛋白3类似物(也称NIX)介导PC12细胞线粒体自噬的可能机制。方法PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)放置于含体积分数1%O2的缺氧培养箱中培养,建立细胞缺氧损伤模型。分为常氧组和不同时相点缺氧损伤组(缺氧6,12,24,48 h组)。Western blot检测缺氧不同时相点NIX、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、线粒体外膜转位酶20(TOMM20)和细胞色素C氧化酶4(COX4)的表达水平。电镜观察PC12细胞缺氧24 h后细胞中自噬体的形成。激光共聚焦显微镜观察NIX过表达48 h后细胞中线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体的形成。免疫共沉淀(CoIP)检测NIX与LC3之间的相互作用。激光共聚焦显微镜观察抑制NIX对线粒体形态的影响。PC12细胞分为常氧组、常氧+NIX抑制组、缺氧组、缺氧+NIX抑制组Western blot检测抑制NIX后各组NIX、LC3、TOMM20、COX4蛋白的表达变化。结果PC12细胞缺氧24 h后NIX和LC3的表达量与常氧组相比明显升高[(0.44±0.03)∶(0.21±0.01)、(1.04±0.03)∶(0.32±0.01)](P均<0.05);TOMM20和COX4的表达量在缺氧24 h后较常氧组明显降低[(0.78±0.07)∶(1.46±0.08)、(0.52±0.04)∶(0.98±0.06)](P均<0.05)。电镜观察发现,缺氧24 h后细胞中有包含线粒体的自噬体形成。激光共聚焦检测发现,NIX过表达48 h后细胞中线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体的形成。CoIP检测发现,NIX与LC3之间存在相互作用。激光共聚焦显微镜观察发现,与缺氧组相比,抑制NIX能保存缺氧条件下线粒体的完整性。Western blot检测发现,与缺氧组相比,缺氧+NIX抑制组中NIX和LC3-II的表达[(0.80±0.02)∶(1.18±0.06)、(0.68±0.05)∶(0.97±0.13)](P均<0.05),使TOMM20和COX4的表达量升高[(0.78±0.06)∶(0.69±0.08)、(0.81±0.07)∶(0.81±0.07)](P均<0.05)。结论在PC12细胞中NIX与LC3相互作用介导线粒体自噬的发生,抑制NIX能保存缺氧条件下线粒体的完整性、降低自噬水平,为线粒体提供保护作用。

二甲双胍对创伤性脑损伤后神经元凋亡的影响及机制

目的探讨二甲双胍(MET)对创伤性脑损伤(TBI)后神经元凋亡的影响及可能机制。方法选择小鼠海马神经元(HT22)细胞进行实验,将HT22细胞随机分为对照组、TBI组、MET1、MET2组,除对照组外,其余组通过机械划痕构建TBI体外模型。Westem blotting法测定Bcl-2腺病毒E1B-19 kD相互作用蛋白3(BNIP3)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62、线粒体外模转位酶20(TOMM20)、细胞色素C氧化酶4(COXⅣ)表达,免疫荧光双染观察线粒体和溶酶体共定位情况,TUNEL染色法检测细胞凋亡率,LDH试剂盒检测细胞上清液LDH活性。应用小干扰RNA(siRNA)抑制BNIP3表达,并随机分为对照siRNA组、BNIP3-siRNA组、对照siRNA+TBI组、BNIP3-siRNA+TBI组,实验终点观察上述指标变化。结果TBI组神经元凋亡率高于对照组(P<0.05)。TBI组BNIP3表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ值均高于对照组(P均<0.05),而p62、TOMM20、COXⅣ表达均低于对照组(P均<0.05)。激光共聚焦显微镜观察发现,TBI组细胞线粒体溶酶体共定位较对照组增加。MET 1组和2组神经元凋亡率均低于TBI组(P均<0.05),且MET 2组细胞凋亡率较MET 1组进一步降低(P<0.05)。MET 1组BNIP3表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ值均较TBI组降低(P均<0.05);MET 2组BNIP3表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ值较MET 1组进一步降低(P均<0.05)。MET 1组p62、TOMM20、COXⅣ表达均较TBI组升高(P均<0.05);MET 2组p62、TOMM20、COXⅣ表达较MET 1组进一步升高(P均<0.05)。激光共聚焦显微镜观察发现,MET 1组细胞线粒体溶酶体共定位较TBI组减少,MET 2组细胞线粒体溶酶体共定位较MET 1组进一步减少。对照siRNA+TBI组及BNIP3-siRNA+TBI组细胞凋亡率分别为(32.57±2.68)%、(16.59±1.80)%,差异有统计学意义(P<0.05)。对照siRNA+TBI组BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ值分别为0.66±0.01、1.46±0.02,高于BNIP3-siRNA+TBI组(P均<0.05);而对照siRNA+TBI组p62、TOMM20、COXⅣ相对表达量分别为0.06±0.01、0.14±0.01、0.09±0.01,低于BNIP3-siRNA+TBI组(P均<0.05)。激光共聚焦显微镜观察发现,对照siRNA+TBI组线粒体溶酶体共定位较BNIP3-siRNA+TBI组增加。结论MET可抑制TBI后神经元凋亡,其机制可能与抑制BNIP3介导的线粒体自噬有关。

地马煎剂对溃疡性结肠炎大鼠肠上皮细胞BNIP3蛋白与mRNA的影响

目的:通过观察地马煎剂对腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白-3(BNIP3)蛋白及mRNA的调控水平,了解其在干预溃疡性结肠炎(UC)线粒体自噬及控制炎症中的机制。方法:60只SPF级SD大鼠随机分为空白组,模型组,地马煎剂低、中、高剂量(8.5,17.0,34.0 g·kg^-1)组,美沙拉嗪(3.0 g·kg^-1)组,每组10只。模型组高脂饮食+2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)+乙醇法建立活动期UC大鼠模型,给药组连续灌胃14 d。苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠结肠黏膜组织病理变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肠上皮细胞BNIP3蛋白及mRNA的表达。结果:HE染色结果显示,模型组大鼠结肠组织可见大量炎性细胞浸润以及非干酪样肉芽组织,而各给药组大鼠出现不同程度的纤维性修复等表现。与正常组比较,模型组BNIP3蛋白及mRNA表达均明显升高(P<0.05);与模型组比较,地马煎剂低、中、高剂量组及美沙拉嗪组BNIP3蛋白及mRNA表达均显著升高(P<0.01);与地马煎剂低剂量组比较,地马煎剂中、高剂量组及美沙拉嗪组BNIP3蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论:地马煎剂可增加UC活动期大鼠肠上皮的BNIP3表达,这可能是其促进线粒体自噬对抗UC炎症的机制之一。

基于HIF-1α/BNIP3信号通路调控线粒体自噬探讨通脉开窍丸治疗血管性痴呆大鼠的机制

目的:观察通脉开窍丸对血管性痴呆(VD)大鼠海马体缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路及线粒体自噬的影响。方法:将90只雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机抽选10只作为假手术组,仅分离颈总动脉不结扎,剩余大鼠将采用颈总动脉分次结扎法制作VD大鼠模型。剔除死亡和造模不成功的大鼠后,将造模成功的大鼠随机分为模型组、通脉开窍丸高、中、低剂量组(27.6、13.8、6.9 g·kg^(-1))、盐酸多奈哌齐组(0.45 mg·kg^(-1))、联合组(通脉开窍丸高剂量27.6 g·kg^(-1)+HIF-1α抑制剂YC-12.5 mg·kg^(-1)),各组对应治疗4周后取材。尼氏染色法观察海马区神经元丢失情况;苏木素-伊红(HE)染色观察海马区病理学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织HIF-1α、BNIP3、自噬效应蛋白-1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白表达水平;透射电镜观察海马组织线粒体超微结构及自噬小体数量;免疫荧光(IF)观察海马组织HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01),海马区神经元层次减少,数量骤减,结构排列不齐,尼氏小体数量减少,丢失严重,线粒体嵴紊乱,线粒体双模结构破坏,损伤加重,自噬小体数量增加,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,通脉开窍丸各治疗组、盐酸多奈哌齐组大鼠寻找平台时间缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.01),HE染色显示,海马神经元细胞数量增多,形态正常,排列整齐,尼氏小体丰富,丢失减少,损伤减轻,自噬小体数量增多,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01)。与通脉开窍丸高剂量组比较,联合组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),穿越平台次数显著降低(P<0.01),海马神经元细胞数量减少,损伤加重,尼氏小体数量下降,自噬小体数量有所减少,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达显著降低(P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度显著下降(P<0.01)。结论:通脉开窍丸可能通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路,促进线粒体自噬的发生,清除功能受损的线粒体,为健康细胞提供能量,减少神经细胞死亡,促进脑功能的恢复,从而减轻大鼠海马组织的缺血性损伤,提高大鼠学习记忆能力,从而发挥对VD的治疗作用。

短暂性全脑缺血／再灌注损伤致大鼠海马组织BNIP3表达水平的改变

目的观察全脑缺血／再灌注损伤后大鼠海马组织Bcl2／腺病毒E1819kD相互作用蛋白3（BNIP3）表达水平的改变。方法取10只成年雄性Wistar大鼠，采用随机数字表法分为假手术组和全脑缺血／再灌注72h组．每组5只．通过尼氏染色检测缺血模型是否引起海马神经元死亡。另取14只成年雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为假手术组（4只1、全脑缺血／再灌注1h组（5只）、全脑缺血／再灌注6h组（5只）。在全脑缺血／再灌注后，于对应时间点取三组大鼠海马组织制备蛋白样品，Westernblot检测各时间点BNIP3表达水平的改变。结果（1）与假手术组比较，全脑缺血／再灌注72h组中海马CA1区神经元形态不规则，细胞皱缩，胞核碎裂消失，表明海马神经元死亡。（2）大鼠海马组织BNIP3单体表达水平在全脑缺血／再灌注后上调，与假手术组相比，全脑缺血／再灌注1h组（2．543±0．473）与全脑缺血／再灌注6h组（2．942±0．777）的海马组织BNIP3单体蛋白表达水平都升高，差异有统计学意义（P〈0．05），但全脑缺血／再灌注1h组与全脑缺血／再灌注6h组间比较差异无统计学意义伊〉0．05）。BNIP3双聚体在各时间点表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论全脑缺血／再灌注损伤可以引起大鼠海马组织BNIP3单体表达水平上调。

大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病大鼠内脏脂肪线粒体自噬及棕色化影响

目的:观察大黄黄连泻心汤加味对肥胖2型糖尿病(T2DM)模型ZDF大鼠内脏脂肪组织线粒体自噬及棕色化的影响。方法:将40只ZDF大鼠高脂饲料诱导为肥胖T2DM模型,随机分为模型组、二甲双胍组(0.18 g·kg^(-1))、大黄黄连泻心汤加味高、中、低剂量组(2.16、1.08、0.54 g·kg^(-1)),每组8只,另取8只ZDF(fa/+)大鼠作为正常组,灌胃体积均为10 mL·kg^(-1),模型组和正常组灌服等体积纯净水,1次/d,持续12周。定期检测大鼠空腹血糖(FBG);干预12周后检测大鼠体质量、附睾脂肪质量、血清中葡萄糖(GLU)、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色观察附睾脂肪组织病理形态学改变;透射电镜(TEM)观察脂肪细胞线粒体自噬情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测附睾脂肪低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、泛素结合蛋白1(p62)、解偶联蛋白1(UCP1)、碘代甲状腺素2(Dio2)、PR结构域结合因子16(Prdm16)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B、p62及UCP1蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠附睾脂肪出现病理学改变;脂肪细胞线粒体固缩、自噬小体较多并发生线粒体自噬;大鼠体质量、附睾脂肪质量、FBG、GLU、GSP、TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01),附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),p62、UCP1 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01),Dio2、Prdm16 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠附睾脂肪组织病变不同程度减轻;二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠脂肪细胞胞浆中线粒体形态结构完整,嵴清晰,基质均匀,胞浆中可见少量自噬溶酶体和自噬小体;二甲双胍组、大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠体质量及附睾脂肪质量均显著降低(P<0.01);各给药组大鼠附睾脂肪指数均明显降低(P<0.05);各给药组大鼠FBG均显著降低(P<0.01);二甲双胍组及大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组大鼠血清中GSP、GLU、TG、LDL-C水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组大鼠血清TC水平显著降低(P<0.01),各给药组大鼠血清HDL-C水平均明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高、中剂量组附睾脂肪HIF-1α、BNIP3、LC3B mRNA及蛋白表达明显降低,UCP1蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);二甲双胍组和大黄黄连泻心汤加味高剂量组p62、Dio2、Prdm16 mRNA及p62蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:大黄黄连泻心汤加味可能通过HIF-1α/BNIP3/LC3B途径抑制内脏脂肪组织线粒体自噬,促进脂肪棕色化,改善肥胖T2DM糖脂代谢。