合肥首例恙虫病病人血中东方体56kDa外膜蛋白部分基因的扩增及进化分析

采用恙虫病胶体金快速诊断试剂对安徽省合肥市一例不明原因发热病人血清进行检测，从该病人血块中提取DNA为模板，用恙虫病东方体特异性引物，PCR扩增出56kDa外膜蛋白部分基因，将扩增目的片段克隆至T载体进行测序并进行基因进化分析。结果显示，该病人血清中抗恙虫病东方体总抗体、抗东方体IgG及抗东方体IgM阳性；患者给予强力霉素治疗后迅速退热。采用PCR从病人血标本中扩增出1320bp东方体56kDa外膜蛋白基因片段，将基因片段测序结果在NCBI上做BLAST比对，显示该基因序列与昆明株和内蒙古株同源基因序列完全一致；进化树分析显示该序列与标准株Kuroki位于同一个分支。研究确认该发热病例为合肥市报告的首例恙虫病，其感染的恙虫病东方体为Kuroki型，推测合肥市可能为恙虫病新疫区。

马鹿布氏杆菌25kDa外膜蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆马鹿布氏杆菌ML分离株25kDa外膜蛋白(Omp25)基因,并在大肠杆菌中表达。方法运用RT-PCR技术从马鹿布氏杆菌分离株中扩增出Omp25基因,将其克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定和遗传变异分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。结果该基因全长642bp,编码213个氨基酸;其中前23个氨基酸残基构成信号肽。在推导的氨基酸序列中,存在两个跨膜区,但没有潜在的N-联糖基化位点。与GenBank中已经登录的布氏杆菌其他11个分离株相比,马鹿布氏杆菌分离株Omp25基因变异较小,以散在的点突变为主,Omp25基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.1%-99.4%和99.2%-99.5%之间。转化重组质粒pETOMP25的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出具有反应原性的目的蛋白,表达量占菌体蛋白的18.6%。结论马鹿布氏杆菌分离株与流产型布氏杆菌其它分离株Omp25基因同源性很高,可能是一个毒力较强的野毒株。

贝氏柯克斯体27kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 克隆和表达贝氏柯克斯体 (Coxiellaburnetii) 2 7kDa外膜蛋白基因 (com1 )。方法 采用PCR方法 ,从质粒pGEM -T/com1扩增出Com1基因片段 ,经鉴定后 ,将其克隆于原核表达载体 pQE30 ,构建成重组质粒 pQE30 /com1 ,IPTG诱导表达。结果 (1 )获得长约 760bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知com1序列相同。 (2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 2 7kDa处有表达条带。经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌体蛋白的 1 7 2 %。 (3)经分析 ,有较好的抗原性。 (4)表达菌体超声破碎后 ,目的蛋白主要存在于包涵体中。结论 贝氏柯克斯体com1基因在大肠杆菌中获得了高效表达 。

百日咳杆菌69KDa外膜蛋白的分离纯化及生物学特性研究

本文发展了一种从百日咳杆菌Ⅰ相菌株中纯化６９ＫＤａ外膜蛋白的简易方法，将细菌体经加热浸提、乙醇沉淀蛋白、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ＿（５０）柱层析精制而成。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹、光密度仪扫描分析，证明纯化制剂为均一的、特异性的６９ＫＤａ外膜蛋白，其收率为５４．２％，纯度达９９．２％，每微克６９ＫＤａ蛋白制。剂中内毒素含量低于０．８５ＥＵ；ＰＴ残留量小于０．１０５ｎｇ。ｆＬ６９ＫＤａ蛋白抗血清能凝集含有３因子凝集原的百日咳菌株。用纯化的６９ＫＤａ蛋白免疫小鼠，能够保护小鼠抵抗致死剂量的１８３２３菌株的脑内攻击，与ＰＴ、ＦＨＡ组成的无细胞百日咳菌苗的效力，较含ＰＴ和ＦＨＡ的组分菌苗为高。表明６９ＫＤａ蛋白与ＰＴ、ＦＨＡ显示协同保护作用，有望成为无细胞百日咳菌苗的另一候选组分。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法 采用PCR方法 ,从Ot Gilliam株菌种基因组DNA中扩增出 5 6kDa外膜蛋白基因片段 ,将目的基因片段定向插入原核表达载体pQE30 ,再用重组质粒转化大肠杆菌 ,最后用IPTG诱导转化菌 ,SDS -PAGE和Western -blotting检测重组质粒目的基因的表达。结果 (1)获得长约 15 0 0bp的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因 ,SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量5 6× 10 4处有表达带 ;(2 )DNA测序证明重组质粒 pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报告的Ot Gilliam株 5 6kDa外膜蛋白基因序列基本一致。 (3)诱导表达菌体经超声破碎后 ,显示目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4 )免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子量约为 5 6× 10 4的独特蛋白带 ,该蛋白约占细菌蛋白总量的 2 9 4 %。结论 Ot Gilliam株5 6kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌中获得了高效表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性 ,与Ot Gilliam株感染的小鼠血清在免疫印迹中呈阳性反应。

布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立

【目的】由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用。本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点。【方法】本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5ΔBP26。分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力。根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株。【结果】成功构建了BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性。小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为102.9,而突变株为101.1(P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱。根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫。【结论】基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础。