山奈酚调控ROS/TXNIP通路对膝骨关节炎大鼠软骨细胞氧化及炎性损伤的改善作用

目的探讨山奈酚通过调控活性氧/硫氧还原蛋白相互作用蛋白(ROS/TXNIP)通路对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨细胞氧化及炎性损伤的改善作用。方法采用改良Hulth法构建KOA大鼠模型,分为模型组,山奈酚组(灌胃50 mg/kg山奈酚),氧化三甲胺(TMAO)组(灌胃110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO),山奈酚+TMAO组(灌胃50 mg/kg山奈酚和110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO),另取假手术组大鼠作为对照。各组大鼠给药结束后,苏木素-伊红染色观察软骨组织损伤情况并对其进行Mankin评分;ROS比荧光探针DCFH-DA法检测ROS水平;Griess法测定一氧化氮(NO)水平;试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平;Western印迹法检测TXNIP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3表达水平。结果与假手术组比较,模型组和TMAO组膝关节软骨损伤严重,细胞排列紊乱,Mankin评分、软骨组织中ROS水平、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及TXNIP、NLRP3蛋白表达水平明显升高,SOD、GSH-Px含量明显减少(均P<0.05)。与模型组比较,山奈酚治疗后,上述指标均得到逆转,氧化和炎性损伤均得到改善(均P<0.05)。与山奈酚组比较,山奈酚+TMAO组软骨组织损伤加重,ROS水平、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及TXNIP、NLRP3蛋白表达水平显著升高,SOD、GSH-Px含量显著降低(均P<0.05)。结论山奈酚可改善KOA大鼠软骨细胞氧化和炎性损伤,其机制与抑制ROS/TXNIP通路,进而调控氧化标志物和炎性因子水平有关。

山奈酚的抗肿瘤机制研究进展

山奈酚是一种黄酮醇类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤等生物活性,尤其是在肿瘤防治方面具有重要作用。山奈酚主要通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、迁移和侵袭、促进宿主的免疫反应等作用来发挥抗肿瘤的活性。因此,笔者进行了有关综述,以期将山奈酚被开发作为预防和治疗肿瘤药物提供一定的理论基础。

磺丁基-β-环糊精-山奈酚的制备工艺及理化性能

采用相溶解度法研究2-磺丁基-β-环糊精对山奈酚的增溶作用和包合常数;以包合率为考察指标,考察包合工艺及包合过程中的理化性质变化规律。结果表明,磺丁基-β-环糊精-山奈酚包合物的相溶解度曲线为AL型,以n(磺丁基-β-环糊精)∶n(山奈酚)=1∶1形成包合物;最佳包合条件为m(磺丁基-β-环糊精)∶m(山奈酚)=3,t=40℃,t=4 h;t=45℃、c(磺丁基-β-环糊精)=1×10^(-2) mol/L,磺丁基-β-环糊精对山奈酚的增溶效果达到39.45倍;增溶效果在一定范围内与温度正相关;包合过程的热力学参数ΔG、ΔH和ΔS分别为-25.902 kJ/mol(318 K)、41.815 kJ/mol和213.51 J/(mol·K),表明包合反应为吸热反应,升高温度有利于包合反应的进行,反应能够自发进行;磺丁基-β-环糊精对山奈酚是一种较好的增溶载体。

山奈酚通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路改善视网膜氧化应激损伤

目的探讨山奈酚减轻视网膜氧化应激损伤的作用机制。方法H_(2)O_(2)处理ARPE-19细胞,构建体外视网膜氧化应激损伤模型,CCK-8评估细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡。25只雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、模型组及山奈酚低剂量(12.5 mg/kg)组、中剂量(25 mg/kg)组和高剂量(50 mg/kg)组;对照组动物正常饲养,模型组和治疗组动物给予急性视网膜缺血/再灌注损伤处理,构建视网膜氧化应激损伤模型。检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的细胞内活性,H-E染色观察视网膜结构完整性,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性细胞因子的表达,Western blot评价凋亡自噬的表达和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)/雷帕霉素机制靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。结果体外细胞实验表明,与对照组相比,山奈酚能显著提高ARPE-19氧化应激损伤细胞的活力和减少细胞凋亡(P<0.05)。体内实验表明,与模型组相比,山奈酚能减轻视网膜氧化应激损伤;显著降低MDA表达和升高SOD表达(P<0.05);显著降低血管内皮生长因子(VEGF)和γ-干扰素(IFN-γ)的分泌,增加白细胞介素-10(IL-10)的分泌(P<0.05);同时能显著增强B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)、PI3K、磷酸化mTOR(p-mTOR)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达,抑制Bcl-2同源结构域蛋白1抗体(Beclin1)表达(P<0.05)。结论山奈酚通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路减轻视网膜氧化应激损伤。

山奈酚活性单体治疗骨质疏松症的相关信号通路

背景:近年研究表明,骨质疏松症的发生和预防常集中在细胞分子学水平,相关信号通路的作用机制是深入了解骨质疏松症的重要途径。目前,中医药已被证实在抗骨质疏松方面具有显著作用,山奈酚作为新兴的中草药提取物,其抗骨质疏松的有效性及作用机制逐渐得到学者们认可,其临床与基础研究逐渐被大家重视。目的:分析、整理国内外文献,进一步了解山奈酚活性单体通过调控相关信号通路发挥抗骨质疏松作用的机制。方法:以“山奈酚,骨质疏松症,成骨细胞,破骨细胞,骨髓间充质干细胞,信号通路”等为中文检索词,检索中国知网、万方、维普数据库;以“kaempferol,Osteoporosis、Osteoblasts,Osteoclasts,Bone mesenchymal stem cells,Signal pathway”等为英文检索词,检索PubMed、WebofScience、Embase数据库,选择各数据库建库至2023年2月的相关文献。结果与结论:①山奈酚通过参与调控骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖和凋亡从而在不同程度上影响骨质疏松症的发生和进展。山奈酚通过对多种信号通路的调控来防治骨质疏松症。②山奈酚通过干预Wnt/β-catenin信号通路调控β-catenin数量以及β-catenin-TCF/LEF复合体形成过程来促进成骨细胞增殖分化,抑制破骨细胞形成。③山奈酚通过干预RANKL/RANK通路维持成骨/破骨细胞动态平衡和骨稳态。④山奈酚通过干预PI3K/Akt信号通路上调相关成骨因子Runx2、Osterix水平及促骨细胞钙化促进成骨。⑤山奈酚通过调控ER/ERK通路干预雌激素缺失导致的破骨分化并抑制活性氧的活性。⑥山奈酚通过干预MAPK通路抑制ERK、JNK、p38/MAPK的表达及降低活性氧生成而保护成骨。⑦山奈酚通过BMP/samd通路增强成骨因子骨形态发生蛋白2、p-Smad1/5/8、β-catenin和Runx2的表达并抑制过氧化物酶体增殖激活受体表达而促进成骨细胞分化、增殖。

基于网络药理学探讨山奈酚-7-O-新橘皮糖苷抗前列腺癌的作用机制

目的 探讨山奈酚-7-O-新橘皮糖苷(kaempferol-7-O-neohesperidoside, K7ON)抗前列腺癌细胞(prostate cancer, PCa)的作用及潜在分子机制。方法 采用CCK-8法检测K7ON对PCa细胞PC3、DU145、C4-2和LNCap增殖的影响;应用细胞划痕实验检测K7ON对DU145细胞迁移能力的影响;SuperPred等数据库获取K7ON和PCa的靶点;从Venny在线平台获取K7ON与PCa的共同靶点,应用String和Cytoscape构建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络;通过DAVID数据库进行GO和KEGG功能富集分析,构建“药物-靶点-疾病-通路”网络模型。通过流式细胞术检测K7ON对PCa细胞周期的影响;采用Western blot法检测周期相关蛋白Skp2、p27和p21蛋白的表达;应用Sybyl X2.0将Skp2与K7ON进行分子对接。结果 K7ON可显著抑制PCa细胞的增殖和迁移能力。筛选出药物与疾病的交集靶点共34个,其中Skp2、p27等是K7ON治疗PCa的关键靶点,进一步的GO和KEGG功能功能富集表明其机制主要与细胞周期相关。流式细胞术结果表明,K7ON处理可使DU145细胞周期阻滞在S期。与对照组相比,Skp2蛋白表达水平明显下调,p27和p21的蛋白表达水平上调。分子对接结果显示K7ON与受体Skp2具有较好的结合能力。结论 K7ON可抑制PCa细胞的增殖和迁移,使细胞周期阻滞在S期,其机制可能与调控Skp2-p27/p21信号通路相关。

山奈酚对高糖诱导的人肾上皮细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究山奈酚对高糖诱导人肾上皮细胞(Hkb20)增殖及凋亡的影响。方法 分组培养人肾上皮细胞分为正常糖浓度组(对照组)、高糖组、氯沙坦组(阳性对照)和不同浓度山奈酚组(10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L山奈酚与高糖共同作用)。采用CCK-8法和AV/PI法应用流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况,qRT-PCR检测TGF-β1和Smad3 mRNA水平的表达,Western blot法检测细胞因子TGF-β1和Smad3蛋白含量。结果 高糖能诱导人肾上皮细胞增殖降低,使细胞凋亡率升高,增加TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。不同浓度山奈酚处理后,山奈酚能显著增强细胞增殖和降低细胞凋亡率。同时TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平下降,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 山奈酚可逆转高糖诱导的人肾上皮细胞增殖降低和凋亡增加。这说明山奈酚可能是通过TGF-β1/Smad3信号通路抑制高糖环境下人肾上皮细胞的增殖降低和凋亡增加,从而最终导致肾脏纤维化。

山奈酚治疗小鼠干眼模型的药效学研究

目的考察山奈酚对小鼠干眼模型的体内药效学研究。方法用药物结合干燥环境诱导建立小鼠干眼模型,随机将小鼠分为5组,分别为空白对照组(N)、模型组(M)、阳性药组(Y)、山奈酚低浓度组(S1)、山奈酚高浓度组(S2),每组各5只。造模给药周期14天,第14天对各组小鼠进行泪液分泌量检测(SIT)、泪膜破裂时间检查(BUT)、角膜上皮损伤评分,并对其眼球及眼睑附属器进行组织病理学检查,考察角膜上皮层厚度、结膜上皮杯状细胞密度以及角结膜上皮细胞凋亡情况。结果与模型组相比,山奈酚低浓度组在SIT、角膜上皮损伤评分、结膜上皮杯状细胞密度以及结膜上皮细胞凋亡,具有显著性差异(P<0.05)。山奈酚高浓度组在SIT、角膜上皮损伤评分、角膜上皮层厚度、结膜上皮杯状细胞密度以及角结膜上皮细胞凋亡,均具有显著性差异(P<0.05)。结论山奈酚能够减轻由干眼引起的小鼠眼表损伤,增加泪液分泌量,并能够抑制角膜上皮细胞和结膜上皮细胞凋亡,改善角膜屏障功能。

山奈酚对SD雄性大鼠离体胸主动脉的舒张作用及机制

目的探究山奈酚(kaempferol,Ka)对SD雄性大鼠离体胸主动脉的舒张作用及机制方法使用多通道离体血管张力测定系统(DMT620M),以血管环舒张率为评估标准,评价Ka对大鼠离体胸主动脉血管环张力的影响。先使用N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)、吲哚美辛(IMC)4-氨基吡啶(4-AP)、四乙基铵(TEA)、氯化钡(BaCl_(2))、格列苯脲(GLB)预孵育大鼠离体胸主动脉血管环,再利用去甲肾上腺素(NE)预收缩血管环,探究Ka舒张离体胸主动脉环的作用机制。进一步利用分子对接方法预测Ka结合钾离子通道作用结合位点。结果Ka能有效舒张NE预收缩的血管环,以上工具药在一定程度上能对抗Ka的舒血管作用(P<0.05)。其中TEA对Ka的舒血管作用影响最大(平均舒张率为20.51%±7.89%,对照组为56.78%±2.04%),GLB对Ka的舒张作用影响最小(平均舒张率为42.64%±4.08%,对照组为56.78%±2.04%)。分子对接结果显示,Ka与7个钾离子通道靶标蛋白的结合自由能均低于5.0kcal/mol,与ATP敏感内向整流器钾离子通道8的结合自由能最小,为-8.6kcal/mol;与内向整流器钾离子通道2的结合自由能最大,为-6.5kcal/mol。结论Ka有舒张雄性大鼠离体胸主动脉血管环的作用,作用机制可能与其依赖于血管内皮及4类钾离子通道有关。

山奈酚靶向B细胞淋巴瘤2相关蛋白A1抑制肾透明细胞癌细胞生物行为

目的 探讨山奈酚(Kaempferol)靶向B淋巴细胞瘤2相关蛋白(BCL2)A1抑制肾透明细胞癌(ccRCC)细胞的作用机制。方法 将ccRCC细胞(ACHN和769-P)分成Vector组(转染空载质粒)或Control组(正常培养)、Kaempferol组(Kaempferol处理细胞)和Kaempferol+BCL2A1组(转染BCL2A1并用Kaempferol处理)。生物信息学预测Kaempferol靶点并分析其与临床不良表型之间关系。噻唑蓝(MTT)检测不同浓度Kaempferol处理细胞的活力。CCK-8试剂盒和克隆形成检测细胞增殖能力。Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力。裸鼠移植瘤实验检测Kaempferol体内抑制细胞增殖能力。免疫组化检测增殖细胞抗原Ki67。Western印迹检测BCL2A1及上皮细胞间质转化(EMT)相关蛋白表达。结果 生物信息学数据库和软件分析显示,Kaempferol靶向BCL2A1,BCL2A1在ccRCC组织中表达上调且与临床不良表型有关。Kaempferol浓度和时间依赖性明显抑制ccRCC细胞BCL2A1蛋白表达(P<0.05)。以120或150μmol/L浓度分别作用ACHN、769-P细胞后,细胞活力明显下降(P<0.05)。以相应浓度Kaempferol作用细胞后,ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05)。Kaempferol组移植瘤体积、重量、Ki67相对表达量和BCL2A1蛋白表达明显小于Control组(P<0.05)。与Vector组相比,BCL2A1组中BCL2A1蛋白表达明显增加(P<0.05)。与Control组相比,Kaempferol组中BCL2A1蛋白表达、增殖细胞、克隆细胞、迁移和侵袭细胞数明显减少(P<0.05);与Kaempferol组相比,Kaempferol+BCL2A1组上述指标明显增多(P<0.05)。细胞经Kaempferol干预后,E-cadherin蛋白表达明显增加,N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显减少,而BCL2A1可明显逆转Kaempferol对EMT相关蛋白表达的影响(P<0.05)。结论 Kaempferol可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,其可能是通过靶向调节BCL2A1蛋白表达,影响EMT相关蛋白表达实现的。

山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探究山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响和机制。方法:利用随机数字法将H9C2大鼠心肌细胞随机分为三组,对照组细胞在常规孵箱培养,缺氧/复氧组细胞利用缺氧孵箱和常规孵箱交替培养,山奈酚组细胞在缺氧/复氧培养的基础上应用30μmol/L山奈酚。分别利用流式细胞仪和多核苷酸链断裂技术检测各组细胞凋亡水平,利用蛋白印迹技术检测凋亡相关蛋白和钙离子通道蛋白含量,利用免疫荧光技术检测细胞中钙离子浓度。结果:和对照组比较,缺氧/复氧组细胞凋亡增加,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和细胞中钙离子含量增加(均P<0.05);和缺氧/复氧组比较,山奈酚组细胞凋亡减少,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度减少(均P<0.05)。结论:山奈酚可能通过减少钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度抑制缺氧/复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡。

山奈酚腹腔注射后脑出血大鼠脑组织神经炎症反应及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达观察

目的观察山奈酚腹腔注射后脑出血大鼠脑组织神经炎症反应及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达,以探讨山奈酚对大鼠脑出血后神经炎症反应的抑制作用及机制。方法72只SD大鼠随机被均分为4组,分别为山奈酚组、山奈酚+PI3K抑制剂LY294002组(抑制剂组)、脑出血组、假手术组。山奈酚组大鼠先建立脑出血模型,成功后腹腔注射山奈酚20 mg/(kg·d),1次/天,连续3 d;抑制剂组大鼠侧脑室先注入PI3K抑制剂LY294002(10µL,10 mmol/L),然后建立脑出血模型,其余步骤同山奈酚组;脑出血组建立脑出血模型后,腹腔注射等体积生理盐水,1次/天,连续3 d;假手术组不建立脑出血模型,仅腹腔注射等体积生理盐水,用法同脑出血组。处理结束后,观察各组脑组织神经炎症反应[神经功能缺损程度(mNSS评分)、脑组织含水量占比、脑血肿周围组织形态结构、脑组织小胶质细胞数量和形态、小胶质细胞标志物Iba-1蛋白及脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平)]情况及脑组织磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白(P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-NF-κB p65/NF-κB p65)表达情况。结果与假手术组比较,脑出血组神经功能评分及脑组织含水量占比均升高(P均<0.05),血肿周围组织排列紊乱、细胞间隙增大、可见大量炎性细胞及红细胞浸润、免疫荧光下可见处于激活状态的小胶质细胞,脑组织Iba-1蛋白相对表达量高(P<0.05),脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子表达水平升高(P均<0.05);与脑出血组比较,山奈酚组大鼠神经功能评分及脑组织含水占比均下降(P均<0.05),脑组织病理形态上均得到改善、小胶质细胞趋于静息态改变,脑组织Iba-1蛋白相对表达量低(P<0.05),脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平下降(P均<0.05);与山奈酚组比较,抑制剂组神经功能评分及脑组织含水量占比均升高(P均<0.05),血肿周围组织排列较紊乱、可见较多的炎性细胞及红细胞浸润、被激活的小胶质细胞增多,脑组织Iba-1蛋白相对表达量高(P<0.05),脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P均<0.05)。与假手术组比较,脑出血组脑组织P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT下降,P-NF-κB p65/NF-κB p65上升(P均<0.05);与脑出血组比较,山奈酚组脑组织P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT上升,P-NF-κB p65/NF-κB p65下降(P均<0.05);与山奈酚组比较,抑制剂组脑组织P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT下降,P-NF-κB p65/NF-κB p65上升(P均<0.05)。结论山奈酚腹腔注射后脑出血大鼠脑组织神经炎症反应减轻,PI3K/AKT信号通路激活。山奈酚能有效抑制大鼠脑出血后神经炎症反应,可能是通过靶向调控PI3K/AKT信号通路起作用的。

不同花色香石竹在发育过程中花青素、总黄酮及山奈酚糖苷的含量变化

为测定不同花色香石竹在花蕾期(F_(1))、初开期(F_(2))、半开期(F_(3))、盛开期(F_(4))以及茎、叶、花萼中花青素、总黄酮、山奈酚3-O-新橙皮苷、山奈酚三糖苷的含量。采用紫外分光光度计法、pH示差法、HPLC法分别测定花青素、总黄酮及山奈酚糖苷含量,比较不同品种之间的差异。结果表明,花青素含量表现为紫色>红色>粉色,绿色和黄色石竹未检测出花青素。随着花的生长,花青素的含量逐渐增高。5种花色中茎、叶和花萼中均未检测到花青素;总黄酮的含量表现为紫色>红色>绿色>粉色>黄色。随着花期的变化,黄酮的含量逐渐减少。所有品种中,花萼中黄酮的含量最低,除粉色石竹的茎中黄酮含量最高,其他品种的石竹叶中的黄酮含量最高;山奈酚三糖苷含量表现为绿色>粉色>紫色>黄色>红色。除红色石竹在初开期(F_(2))中含量最高,其他花色中山奈酚三糖苷随着花期的变化呈下降趋势。5种花色石竹中,茎中山奈酚三糖苷的含量最低。紫色和红色石竹的叶中山奈酚三糖苷的含量最高,粉色、绿色和黄色的花萼中山奈酚三糖苷的含量最高;山奈酚-3-O-新橙皮苷含量表现为粉色>绿色>红色>紫色,黄色石竹未检测出山奈酚-3-O-新橙皮苷。山奈酚-3-O-新橙皮苷含量最高的为初开期(F_(2)),表现为初开期(F_(2))>花蕾期(F_(1))>半开期(F_(3))>盛开期(F_(4))。5种花色的茎和花萼中山奈酚-3-O-新橙皮苷含量较少,叶中含量极少。

山奈酚通过Wnt/β-catenin信号通路调节骨细胞合成代谢进而改善骨质疏松的作用机制

目的在细胞水平探讨山奈酚对成骨细胞的促进作用及对信号通路蛋白Wnt/β-catenin表达的影响。方法复苏与培养小鼠原成骨细胞MC3T3-E1 Subclone14,用不同浓度(1、2、5、10、20、50 mmol/L)的山奈酚处理细胞不同时间(24、48、72 h),利用细胞计数试剂(CCK-8)测定细胞活力,筛选山奈酚最适处理浓度及处理时间。将探究山奈酚促进成骨的相关检测的实验分为对照组与山奈酚组,对照组细胞进行正常培养,山奈酚组细胞用10 mmol/L山奈酚处理24 h;分别利用碱性磷酸酶(ALP)与前列腺素(PG)E2酶联免疫试剂盒、一氧化氮(NO)生化检测试剂盒对细胞内ALP、PGE2与NO含量进行测定;利用Western印迹检测细胞内骨保护蛋白(OPG),核转录因子配体受体激活体(RANKL)及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。Wnt/β-catenin信号通路介导山奈酚作用的实验分为对照组、山奈酚组、MSAB组、MSAB+山奈酚组,对照组细胞进行正常培养,山奈酚组细胞用10 mmol/L山奈酚处理24 h,MSAB组细胞用5 mmol/L MSAB处理24 h,MSAB+山奈酚组用5 mmol/L MSAB与10 mmol/L山奈酚共同处理24 h,利用CCK8检测各组细胞活力;利用Western印迹检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达情况。结果山奈酚最适处理浓度为10 mmol/L,最佳处理时间为24 h。与对照组相比,山奈酚组细胞中ALP含量显著升高(P<0.05),而细胞中PGE2、NO含量显著降低(P<0.05),细胞中OPG蛋白、Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),RANKL蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与山奈酚组相比,MSAB组细胞抑制率显著升高(P<0.05);与MSAB组相比,MSAB+山奈酚组细胞抑制率显著降低(P<0.05);与对照组相比,山奈酚组细胞内Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),MSAB组细胞内Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与MSAB组相比,MSAB+山奈酚组内细胞Wnt1蛋白与p-β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论山奈酚可以增加小鼠原成骨细胞的活力、增殖作用,通过Wnt/β-catenin信号通路发挥促进成骨的作用,可能是其防治骨质疏松的机制。

山奈酚通过上调miR-340-5p减轻脊神经结扎大鼠的神经性疼痛

目的探讨山奈酚(kaempferol,KAE)对脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)大鼠神经性疼痛的作用机制。方法采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠星形胶质细胞建立炎症模型,用山奈酚单独或与miR-340-5p抑制剂共同处理细胞,RT-qPCR检测miR-340-5p表达,ELISA检测炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;荧光素酶报告基因实验验证AKT3与miR-340-5p的靶向关系;Western blotting检测自噬标志蛋白的表达。此外,建立SNL大鼠模型,山奈酚口服给药后,检测miR-340-5p表达,炎症因子以及自噬标志蛋白水平,并测定大鼠机械缩爪阈值和缩爪潜伏期。结果在LPS诱导的星形胶质细胞中,山奈酚上调miR-340-5p表达,抑制IL-1β和TNF-α分泌,转染miR-340-5p抑制剂则逆转山奈酚对miR-340-5p表达的促进作用以及对炎症因子分泌的抑制作用。AKT3被确定是miR-340-5p的靶基因。山奈酚上调miR-340-5p表达,进而阻断AKT3/mTOR信号通路,增强星形胶质细胞自噬。山奈酚给药的SNL大鼠表现出miR-340-5p表达上调,炎症因子分泌减少,自噬相关蛋白表达增加,机械缩爪阈值增加,缩爪潜伏期延长。结论山奈酚通过上调miR-340-5p靶向抑制AKT3/mTOR信号通路,抑制星形胶质细胞炎症反应,增强自噬,减轻SNL大鼠神经性疼痛。

山奈酚通过抑制NLRP3炎症小体介导的脂肪组织炎症改善db/db小鼠胰岛素抵抗发生

目的:探讨山奈酚能否通过调控肥胖小鼠脂肪组织炎症改善胰岛素抵抗发生并研究作用机制。方法:db/m小鼠作为对照组,db/db雄性小鼠随机分为模型组、二甲双胍组(0.15 g·kg^(-1)·d^(-1))和山奈酚组(50 mg·kg^(-1)·d^(-1))。连续灌胃给药6周,每周记录小鼠体重,6周后进行葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验、皮下和附睾白色脂肪组织质量测定;HE染色观察脂肪组织形态学变化,免疫组化法观察巨噬细胞向脂肪组织的浸润程度及巨噬细胞标志物F4/80的表达,实时荧光定量PCR检测TNF-α和IL-18以及Arg-1和IL-10的mRNA表达,蛋白质免疫印迹试验检测NLRP3、pro-caspase1、cle-caspase1和IL-1β表达。结果:与模型组相比,山奈酚能够显著抑制db/db小鼠脂肪质量增加,抑制脂肪细胞肥大。山奈酚组小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润减少,TNF-α和IL-18 mRNA表达减少,Arg-1和IL-10 mRNA表达增加;山奈酚治疗能够抑制小鼠附睾脂肪组织NLRP3、caspase1以及IL-1β表达,抑制NLRP3炎症小体激活。结论:山奈酚可以通过抑制NLPR3炎症小体介导的脂肪组织炎症改善db/db小鼠胰岛素抵抗的发生。

山奈酚联合骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效及机制

目的观察山奈酚联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效并探讨其机制。方法3周龄雄性C57BL/6J小鼠处死后提取BMSCs,12只6周龄C57BL/6J小鼠随机分为对照组、造模组、造模与山奈酚治疗组以及造模与山奈酚联合BMSCs治疗组,每组3只。对照组小鼠自由饮用正常灭菌双蒸水,其余3组小鼠自由饮用含3%葡聚糖硫酸钠的灭菌双蒸水建立溃疡性结肠炎模型,造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BMSCs治疗组小鼠同时给予每日山奈酚灌胃,造模与山奈酚联合BMSCs治疗组在造模第1天、第4天和第7天尾静脉注射提取的BMSCs,其余组小鼠灌注同样量的溶解剂。造模结束后10 d,每天测量小鼠体质量,10 d后取出小鼠结肠,测量小鼠结肠长度。采用流式细胞术检测小鼠结肠组织辅助性T淋巴细胞(Th17)、调节性T淋巴细胞(Treg)比例,ELISA法检测小鼠血浆白细胞介素17A(IL-17A)、IL-10,RT-qPCR法检测小鼠结肠组织IL-17A、IL-10 mRNA。采用HE染色观察小鼠结肠黏膜组织病理学改变,免疫组织化学染色观察小鼠结肠组织肠上皮紧密连接蛋白occludin及ZO-1表达情况。结果结肠长度对照组>造模与山奈酚联合BMSCs治疗组>造模与山奈酚治疗组>造模组(P均<0.05);造模结束后1~10 d,对照组体质量逐渐上升,造模组体质量逐渐下降,造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BMSCs治疗组体质量自第6天开始逐渐上升,且造模与山奈酚联合BMSCs治疗组体质量高于造模与山奈酚治疗组。结肠组织Th17比例造模组>造模与山奈酚治疗组>造模与山奈酚联合BMSCs治疗组>对照组,结肠组织Treg比例对照组>造模与山奈酚联合BMSCs治疗组>造模与山奈酚治疗组>造模组(P均<0.05)。血浆、结肠组织IL-17A表达造模组>造模与山奈酚治疗组>造模与山奈酚联合BMSCs治疗组>对照组,IL-10表达对照组>造模与山奈酚联合BMSCs治疗组>造模与山奈酚治疗组>造模组(P均<0.05)。HE及免疫组化染色结果显示,与造模组比较,造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BMSCs治疗组结肠黏膜组织损伤程度减轻,肠上皮紧密连接蛋白occludin及ZO-1表达增加,且造模与山奈酚联合BMSCs治疗组对结肠黏膜组织损伤的改善作用更加明显。结论山奈酚联合BMSCs治疗溃疡性结肠炎小鼠能够提高疗效,其机制可能与调节Th17/Treg平衡以修复肠道上皮屏障有关。

山奈酚对脓毒症大鼠肝损伤的影响及其与HIF-1α/HK2通路的关系

目的评价山奈酚对脓毒症大鼠肝损伤的影响及其与HIF-1α/HK2信号通路的关系。方法70只健康成年SPF级SD大鼠随机分为五组:对照组(Con组)、脓毒症组(LPS组)、山奈酚处理组(LPS+KAE组)、脓毒症+DMOG处理组(LPS+DMOG组)和脓毒症+DMOG+山奈酚处理组(LPS+DMOG+KAE组),每组14只。采用腹腔注射LPS 10 mg/kg法建立SD大鼠脓毒症模型,不同处理组于LPS注射24 h后分别腹腔注射山奈酚50 mg/kg和(或)DMOG 50 mg/kg。LPS注射48 h后处死各组大鼠,收集肝脏、血液标本。酶联免疫吸附法检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸(Lac)、谷氨酰转肽酶(γGT)、总胆红素(TBIL)及肝脏NF-κB/p65和IL-6活性。比色法检测肝脏过氧化氢酶(CAT)、髓体过氧化物酶(MPO)和丙酮酸含量。HE染色观察肝脏组织病理改变。蛋白质免疫印记电泳检测CD11b、HIF-1α、HK2、p-AMPKα蛋白表达。结果与Con组比较,LPS组血清Lac、ALT、AST、γGT、TBIL含量升高,肝脏乳酸/丙酮酸、NF-κB/p65活性、IL-6含量、MPO含量及CD11b、HIF-1α、HK2蛋白表达明显升高,CAT含量和p-AMPKα蛋白表达明显降低(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+KAE组血清Lac、ALT、AST、γGT、TBIL含量降低,肝脏乳酸/丙酮酸、NF-κB/p65活性、IL-6含量、MPO含量及CD11b、HIF-1α、HK2蛋白表达明显降低,CAT含量和p-AMPKα蛋白表达明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,LPS+DMOG组血清Lac、ALT、AST、γGT、TBIL含量明显升高,肝脏乳酸/丙酮酸、NF-κB/p65活性、IL-6含量、MPO含量及CD11b、HIF-1α、HK2蛋白表达进一步升高,CAT含量和p-AMPKα蛋白表达明显降低(P<0.05)。与LPS+KAE组比较,LPS+DMOG+KAE组血清Lac、ALT、AST、γGT、TBIL含量升高,肝脏乳酸/丙酮酸、NF-κB/p65活性、IL-6含量、MPO含量及CD11b、HIF-1α、HK2蛋白表达升高,CAT含量和p-AMPKα蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论山奈酚可通过抑制HIF-1α/HK2通路改善LPS诱导的库普弗细胞糖代谢重编程,显著改善肝细胞炎症反应和氧化应激损伤。

山奈酚调控细胞衰老治疗类风湿性关节炎的体外研究

目的 基于网络药理学以及体外实验探讨山奈酚治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的机制。方法 通过TCMSP及SwissTarget数据库查询山奈酚靶点,检索GeneCards和DisGeNET数据库,获得RA相关功能靶点。山奈酚与RA靶点通过Venny2.1.0交叉后,利用STRING数据库进行蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)分析,并对山奈酚和靶点进行分子对接。随后用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)与山奈酚处理小鼠单核细胞白血病细胞RAW264.7进行验证,分组为:Control组、LPS组、LPS+Kaempferol组。MTT法检测山奈酚对RAW264.7细胞毒性的影响。使用LPS诱导RAW264.7细胞构建炎症细胞模型,检测各个处理组衰老和衰老相关炎症因子表达的影响。通过SA-β-Gal检测各组RAW264.7细胞β-半乳糖苷酶水平的变化。细胞免疫荧光检测各组IL-6的表达。结果 共得到138个山奈酚的作用靶点,山奈酚抗RA的潜在作用靶点76个。PPI分析结果显示TNF、EGFR、PTGS2、AKT1可能是山奈酚抗RA的核心靶点。分子对接结果表明,山奈酚与核心靶点TNF、EGFR、PTGS2、AKT1能形成较稳定的复合物。MTT结果证明,在24 h时,0.125~16μmol/L山奈酚对RAW264.7细胞增殖均具有促进作用(P<0.05)。在48 h时,0.125~8μmol/L山奈酚能够促进RAW264.7细胞增殖(P<0.05)。而72 h时,0.125~16μmol/L山奈酚对RAW264.7细胞增殖没有显著影响。qPCR和Westerm blot结果表明山奈酚能够降低LPS诱导的IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达(P<0.05)。山奈酚也降低了细胞衰老标志基因p16和p21的表达,同时促进细胞周期标志物CCND1和CCNE1的表达(P<0.05)。免疫荧光结果表明山奈酚能够降低IL-6表达水平(P<0.05)。SA-β-Gal染色结果显示,LPS处理可以促进RAW264.7细胞β-半乳糖苷酶的水平(P<0.05),而山奈酚可以缓解LPS诱导的β-半乳糖苷酶水平增加(P<0.05)。结论 山奈酚可能通过调控炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α与p16/p21衰老相关基因,防止免疫细胞过早衰老,发挥治疗RA的作用。

山奈酚对氯化铜诱导的细胞损伤的预防作用

目的 通过体外实验探讨山奈酚(Ka)对氯化铜(CuCl2)诱导的A53T突变性人源α-synuclein转基因神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的预防作用。方法 CCK8法测定CuCl2的半数抑制浓度(IC50)值,确定染毒浓度。将实验分为对照组、CuCl2处理组(简称模型组)和CuCl2处理前用Ka干预组(简称干预组)。将细胞以5 000个/孔接种到96孔板孵育,24 h后在干预组的培养基中加入30μmoL/L Ka预孵育2 h, 2 h后在模型组和干预组中加入含有Cu2+的培养基,24 h后进行实验。采用酶联免疫吸附测定和免疫印迹实验检测山奈酚对Cu2+干预后细胞乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)、ATP水平和细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达的影响。结果 CuCl2IC50值为117.7μmoL/L,本研究以接近1/2 IC50值为染毒浓度。通过酶联免疫吸附测定结果显示,染毒和干预24 h后,与对照组相比,模型组的LDH(P<0.001)和ROS(P<0.001)含量均增加,ATP(P<0.05)水平下降,Bcl-2(P<0.05)蛋白表达减弱、Bax(P<0.05)蛋白表达增强;Ka预先保护2 h后,与模型组相比,干预组的LDH(P<0.01)和ROS(P<0.001)含量均减少,Bcl-2(P<0.05)蛋白表达增强、Bax(P<0.05)蛋白表达减弱。结论 Cu2+诱导的细胞ATP生成减少与细胞内过氧化水平增加有关,进而引发了细胞凋亡,而山奈酚预先干预可以避免Cu2+诱导的细胞损伤,表现出对细胞的预防性保护作用。