基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼(isoniazid,INH)耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%(48/123)菌株对INH敏感,61.0%(75/123)菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%(52/75)菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N(AGC→AAC)、12株为S315T(AGC→ACC)、7株为S315I(AGC→ATC)、各有3株分别为S315T(AGC→CGC)和S315R(AGC→AGA)、2株为S315G(AGC→GGC)。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。

结核分枝杆菌KatG Asn329Val突变导致异烟肼耐药

目的研究结核分枝杆菌katG基因Asn329Val突变导致异烟肼耐药的机制。方法扩增含有突变位点和野生型的全长katG基因,经TA克隆、定向克隆构建表达载体,原核表达KatG蛋白,纯化后比较重组KatG酶活性。结果获得了katG基因的高效表达。重组蛋白酶活性显示,Asn329Val突变导致重组KatG过氧化氢酶活性完全丧失,但仍保持一定的过氧化物酶活性;Ser315Thr突变导致重组KatG过氧化氢酶和过氧化物酶活性部分丧失;Arg463Leu突变对过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性影响均不大。结论 katG Asn329Val突变引起了KatG过氧化氢酶活性的完全丧失,可能是导致菌株对异烟肼耐药的机制。

结核杆菌分泌蛋白katG基因的克隆、表达及其诊断价值

目的 获得重组katG(简称rkatG)蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化katG蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性 ,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rkatG蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET2 4b -katG在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 2 %～ 56 3 %左右 ,分子质量约为80 0 0 0 ,Westernblotting分析与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rkatG样品经SDS -PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 92 75 %,每 1 0 0ml培养菌可获得 2 8mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 +2s为正常界限值 ,一步法的特异性和敏感性分别为 87 9%(2 9/ 33) ,65 6 %(2 1 / 32 ) ;PPD分别为93 9%(31 / 33) ,62 5 %(2 0 / 32 ) ;rkatG分别为 97 0 %(32 / 33) ,1 5 2 %(5/ 33)。结论 pET2 4b -katG大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rkatG蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性 ,但检测抗结核抗体的灵敏度低。

吉林省耐多药结核分枝杆菌rpoB及katG基因突变特征分析

目的分析吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考。方法对吉林省耐多药结核分枝杆菌菌株扩增rpoB、katG基因测序后比对分析。结果耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG基因的突变率分别为83.53%和70.6%,突变类型包括点突变、联合突变和缺失。在rpoB基因中,82.30%突变发生在RRDR区域,最常见突变位点为rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突变率为70.6%,最常见突变位点为katG315,占所有突变的68.55%。结论吉林省耐多药结核分枝杆菌最常见突变位点为rpoB531、rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG(简称rKatG)蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法重组质粒pET23b-KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白,对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定。结果成功构建了重组质粒pET23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95.6%,过氧化氢酶试验阳性。结论构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白。

基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药水平和katG、inhA、oxyR-ahpC以及rpoB基因突变位置的关联性分析

结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）是一种能够引起结核病的病原菌,除了能够引起常见的肺结核外,还能够侵犯全身多个器官引起相应结核病。肺结核病是由结核分枝杆菌引起的呼吸系统传染病,人感染结核分枝杆菌后是否发病与免疫功能密切相关。目前结核病的诊断和治疗面临着巨大挑战,尤其是难治性结核病及耐药结核病的诊断及有效治疗问题。

耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析

异烟肼（isoniazid,INH）是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用[1]。Zhang等[1]通过Southern印迹杂交（Southernblot）发现结核分枝杆菌katG基因缺失和异烟肼耐药相关。

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法根据结核分枝杆菌katG基因315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μL,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论 TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG315位点突变。

云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征

目的分析云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征。方法采用PCR方法对云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌进行katG和inhA基因扩增,并将扩增产物进行基因测序后比对分析。结果88株异烟肼耐药菌株中,耐药基因与表型药敏结果的符合率为82.95%(73/88),katG和inhA基因突变率分别为75.00%(66/88)和9.09%(8/88)。最为常见的基因突变位点为katG315(67.05%)和inhA-15(7.95%),katG315位点基因突变主要表现为Ser315Thr(59.09%,52/88)。耐多药与单耐异烟肼菌株中katG基因突变比例,差异有统计学意义(χ^(2)=4.190,P=0.041),而inhA基因及katG315、inhA-15位点基因突变比例,差异无统计学意义(P>0.05)。结论云南省异烟肼耐药以katG315和inhA-15基因突变为主,MDR菌株中katG基因突变率高于异烟肼单耐,目前基于基因突变的分子检测技术是检测异烟肼耐药的有效手段。

武汉地区耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变的分子特征分析

结核病是由Mtb感染所致的慢性传染性疾病。近年来，随着MDR和XDR的不断产生，结核病以更严峻的形式威胁着人类的健康。异烟肼（isoniazid，INH）是一个不可或缺的抗结核一线药物。文献报道，异烟肼耐药主要与katG基因突变密切相关。

耐多药结核杆菌分离林KatG及inhA基因变异的研究

目的用直接测序法研究临床分离的多耐药结核杆菌的katG和inhA的基因变异机理。方法用未见报还katG和inhA基因中的片须为引物，PCR法扩增产物，克隆后大量制备质粒，经全自动测序系统测定其DNA序列。结果15株耐INH≥1ug/ml的细菌均有katG突变，主要为点突变。其中14株有463位和315位AA密码子改变。13个变异位点中，9个未见文献报告。关于inhA变异，在18个耐INH≥1ug/ml的菌株中，全部出现inhA基因变异，主要为点突变和缺失，其中又以单个位点变异为主。各菌株之间变异不同。耐式菌株中，katG和inhA同时出现变异的比例较大。结论结核杆菌耐药基因变异机理复杂，我国分离的多耐药结核菌株与国外的菌株上述二基因变异特点不同。

尘肺并发结核患者耐多药结核分枝杆菌L型异烟肼耐药基因katG序列突变特点分析

目的探讨淮南矿区尘肺并发结核患者感染耐多药结核分枝杆菌(multiple drugs resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-MTB)L型异烟肼耐药基因katG突变特点。方法收集114株MTB菌L型临床分离株,用药敏试验鉴定MDR-MTB菌L型;抽提MDR-MTB L型和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增katG基因,并对katG基因的突变集中区域进行测序分析。结果从114株临床分离株中检出MDR-MTB菌L型31株(27.2%),其katG基因突变率为61.3%(19/31);主要集中在315位点碱基置换突变,以Ser315Thr为主(AGC→ACC)(48.4%,15/31),其次是315位点Ser315Asn(AGC→AAC)突变(9.7%,3/31)以及431位点Ala431Val(GCG→GTG)突变(3.2%,1/31),未发现多位点联合突变,12株(38.7%,12/31)未发现katG基因突变;随机检测的10株异烟肼敏感株未见katG基因单链构象异常。结论淮南矿区尘肺并发结核患者感染的MDR-MTB菌L型异烟肼耐药情况较为严重,高度保守的katG基因突变是导致异烟肼耐药的分子基础,其突变位点呈多样性。

95株耐多药结核分枝杆菌katG基因序列分析

目的分析广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变的分子特征。方法应用PCR-测序法对来自广州地区100株耐多药结核分枝杆菌株katG基因的261～330位密码子长度约210 bp目的片段进行序列测定,并与结核分枝杆菌标准株H37Rv菌株katG基因序列(GenBank:X68081.1,1-4810)进行对比,并应用DNASTAR软件推测氨基酸突变情况。在PCR和基因序列测定中,引物设计相同,上、下游引物分别为5'-GAAACAGCGGCGCTGATCGT-3和5'-GTTGTC-CCATTTCGTCGGGG-3'。结果 100株耐多药结核分枝杆菌菌株中,95株成功扩增出katG基因,95株中有70株呈现katG基因突变(73.68%);基因突变类型均为点突变,突变均发生于315位点,未见插入或缺失型基因突变;氨基酸突变包括3种类型,其中:66株发生AGC(Ser)→ACC(Thr)突变即S315T(94.28%),2株发生AGC(Ser)→ATC(Ile)突变即S315I(2.86%),2株发生AGC(Ser)→AAC(Asn)突变即S315N(2.86%)。结论在所测菌株范围内,广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变率和突变类型具有其特点。

广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究

目的本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL关系研究。方法采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB和rpsL基因进行序列分析。结果分离得到耐INH35株、耐RFP27株、耐SM25株。INH耐药株katG基因突变率为71.4%(25/35),RFP耐药株rpoB基因的突变率为81.5%(22/27),SM耐药株rpsL基因突变率为76%(19/25);INH以Ser315Thr突变60%(21/35)最常见,RFP以Ser531Leu突变55.6%(15/27)最常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72%(18/25)常见。结论 katG、rpoB和rpsL基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性。

结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究

目的:探讨结核分支杆菌异烟肼(INH)表型耐药与KatG基因密码子315位和463位基因改变的相关性。方法:采用基因直接测序法对结核分支杆菌分离株KatG基因进行分析。结果:132株异烟肼耐药菌株中68株KatG基因密码子315位有基因突变,突变率51.52%(68/132),野生型密码子315AGC(Ser)突变成ACC(Thr)60株,AAC(Asn)6株,ACA(Thr)1株,GGC(GIy)1株。133株INH敏感菌株未发现KatG 315位基因突变。132株INH耐药菌株中123株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为93.18%,野生型密码子463CGG(Arg)突变成CTG(Leu)123株;133株敏感菌株中114株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为85.71%,野生型密码子463 CGG(Arg)突变成CTG(Leu)114株。结论:①KatG基因315位密码子突变是菌株异烟肼表型耐药的重要分子基础,以Ser315Thr错义突变为主。②KatG基因463位密码子突变与异烟肼耐药表型没有相关性,不是结核杆菌异烟肼耐药的分子标志。该位点突变可能是基因多态性,与结核菌治疗带来的选择性压力无关。

耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究

目的 :建立结核分枝杆菌 (MTB) kat G基因点突变的筛选方法 ,了解结核分枝杆菌耐异烟肼 (INH)的状况。方法 :采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析 (PCR- RFL P)技术 ,对 8株耐 INH的临床 MTB分离株、16株对 INH敏感的临床分离株及 MTB标准株 H3 7Rv的 kat G基因 ,进行聚合酶链 (PCR)反应扩增 kat G基因片段 ,再用 Msp I内切酶分别对 PCR产物进行消化反应。如果有 315位点 AGC突变为 ACC,则将增加一个切点。结果 :检测到 8株耐药株中有 7株增加了一个 Msp I内切酶切点 ,耐药株中 kat G基因点突变检出率为 87.5 % (7/ 8) ;16株敏感株和标准株均无额外的 Msp I内切酶切点。未发现 kat G基因序列的缺失。结论 :kat G基因点突变是 MTB耐 INH的重要机理之一 ;用 PCR- RFLP检测耐 INH的 MTB的 kat G基因点突变具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点。

痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究

目的快速检测痰中耐药结核分枝杆菌katG基因及了解耐异烟肼的分子机制。方法用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增katG基因片段,对扩增获得的katG基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、多耐药但对异烟肼敏感、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到katG基因。从临床分离菌株中随机扩增药敏试验证实的耐多药3株,全耐、包括对异烟肼耐药的多耐、对异烟肼敏感的多耐药、全敏感及H37Rv标准结核分枝杆菌株各1株,均扩增获得273bp片段,序列测定比较发现,2株耐多药菌、1株全耐菌及包括异烟肼耐药的多耐药菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G,1例MDR-TB、全敏感株、对异烟肼敏感的多耐药菌株和标准株均无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌katG基因及其突变,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性与katG基因点突变有关,但可能还存在其它值得探讨的机制。

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG和rpoB的突变特征

目的分析临床分离的结核分枝杆菌katG和rpoB基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法采用比例法对六安地区65株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katC和rpoB进行扩增、测序后进行分析。结果 60株结核分枝杆菌中分别有有9株耐异烟肼和14株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9株耐异烟肼菌株中,4株katG在315(A GC→ACC或ACA)位点发生突变,占44.4%;14株耐利福平菌株中,11株rpoB分别在516(GAC→GTC)、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6%;6株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5株katG或rpoB基因发生突变,占83.3%。结论六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG和rpoB基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315(AGC→ACC或ACA)位,而耐利福平在516(GAC→GTC)、526(GAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。

异烟肼耐药与结核分枝杆菌katG基因突变的研究

探讨异烟肼耐药与结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因突变的。方法用ｋａｔＧ基因５‘端设计的引物对４６株结核分枝杆菌临床分离株进行了ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物进行ＳＳＣＰ分析。结果：４６株结核分枝菌临床分离株均发现ｋａｔＧ基因序列的缺失。对其ＰＣＲ产物进行ＳＳＣＰ分析。

应用分子信标检测MTB耐异烟肼katG基因315codon点突变的实验研究

目的:选择结核杆菌耐异烟肼katG基因包含315codon点突变序列,设计分子信标探针,建立扩增体系及分子信标芯片检测方法。方法:运用软件Beacon designer设计katG基因包含315codon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号。结果:标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;28株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组315codon突变检出率为44%。结论:分子信标技术是一种高灵敏的核酸点突变检测技术;采用荧光显微镜观测荧光信号,具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。