敲除kdm4ab对斑马鱼低温耐受能力的影响

为深入研究kdm4ab基因在鱼类低温胁迫下的作用,以斑马鱼(Danio rerio)为模式生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建kdm4ab^(-/-)斑马鱼品系。RT-qPCR结果显示,与WT斑马鱼相比,kdm4ab^(-/-)斑马鱼的kdm4ab mRNA表达量显著下调(P<0.000 1),而kdm4c的mRNA表达量补偿性增加(P<0.05)。斑马鱼行为轨迹跟踪系统检测发现,18℃低温下kdm4ab^(-/-)斑马鱼幼鱼的最大加速度显著降低(P<0.05)。8℃低温下kdm4ab^(-/-)斑马鱼的半数致死时间(LT50)显著低于WT斑马鱼(P<0.000 1);低温处理后kdm4ab^(-/-)斑马鱼的γH2A.X表达量明显增加,ROS水平升高,即DNA损伤增强。研究表明,敲除kdm4ab基因降低了低温下斑马鱼的耐受能力及运动能力,这为鱼类的低温耐受机制研究提供新思路。

kdm4A在斑马鱼细胞低温胁迫过程中的作用

赖氨酸特异性去甲基化酶4A基因(lysine demethylase 4A,kdm4A)编码的蛋白具有去甲基化酶活性,并且在基因表达调控中起重要作用。该基因在斑马鱼中有两种类型kdm4aa和kdm4ab。本实验室前期对18℃低温胁迫下斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维样细胞(zebrafish embryos fibroblast like cell line,ZF4)的转录组数据分析发现kdm4aa表达量显著降低,但是该基因在鱼类低温胁迫下的作用仍不清楚。为了研究这两种基因在鱼类低温胁迫下的功能,本研究用EcoRⅠ和AgeⅠ酶切构建了pLKO.1-kdm4aa-shRNA、pLKO.1-kdm4ab-shRNA和pLKO.1-negative control(nc)三种重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至293T细胞中,经293T细胞包装的病毒,感染斑马鱼ZF4细胞,RT-qPCR检测表明ZF4细胞中kdm4aa和kdm4ab均成功被敲降。随后将细胞于28℃培养(Control)或经18℃低温处理1 d,使用台盼蓝染色法检测ZF4细胞存活率,并进一步检测了细胞内自噬相关基因beclin1和LC3的表达情况。结果显示:在18℃条件下,敲降kdm4aa的细胞与nc组细胞相比存活率显著上升(p<0.05),而敲降kdm4ab的细胞存活率与nc组相比无明显变化,证明敲降kdm4aa在低温胁迫下保护细胞。进一步的研究发现,敲降kdm4aa的细胞内自噬相关基因beclin1及LC3的表达量均显著上调,而敲降kdm4ab的细胞变化不显著,提示敲降kdm4aa在低温胁迫下对斑马鱼细胞的保护作用可能是通过上调自噬水平引起的。该研究为后期斑马鱼低温胁迫分子机制的研究提供新的思路。