枯草芽孢杆菌角蛋白酶kerC基因在毕赤酵母中的高效表达

以角蛋白酶基因为研究对象,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-3中克隆得到角蛋白酶基因kerC,将其构建在毕赤酵母表达载体pPICZαA上,得到重组质粒pPICZαA-kerC,转入毕赤酵母X-33中,成功实现了角蛋白酶基因kerC在真核表达系统中的高效表达。重组菌株以体积分数1%的甲醇诱导培养108h后,酶活力可达32.31U/mL,提高了11.15倍。重组酶最适温度为60℃,最适pH值为7.5,反应体系中3mmol/L的Co2+、Fe2+和Ca2+能明显增强其酶活力。SDS-PAGE检测表明,重组酶分子质量约为31kD。

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.