酵母质粒Killer系统的研究

从酿酒酵母中筛选出两个具有线状双链RNA质粒的酵母菌株,提取并纯化了它的质粒RNA.用RNase和DNase处理,发现它们能被RNase消化,证明它们是质粒RNA.用电镜观察到它们呈线状,凝胶电泳图谱表明,这些质粒RNA都含有两条带;其分子量分别为3.0×10~6d和1.5×10~6d。

嗜杀苹果酒酵母的构建

采用核融合缺陷原生质体融合技术 ,将嗜杀质粒供体菌 5 0 45 (α ,his4,kar1— 1[KIL—K1 ]rho+ )中的嗜杀质粒转移到受体菌苹果酒酵母AW中去。用 3 5 %PEG ,3 0℃诱导融合 2 0min ,经嗜杀活性检出、小型酿造实验、遗传稳定性实验、细胞大小及体积的测定、dsRNA质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳等实验 ,筛选出 4株遗传性状稳定、具有嗜杀活性且发酵性能良好的融合子F12、F3 0、F5 7、F65。

利用紫外线致死原生质体融合技术选育嗜杀啤酒酵母

本文利用紫外线致死原生质体融合技术,在对酿酒酵母(Sacchromyces cereuisiae)亲株CD4-W不做任何遗传标记的条件下,成功地将对紫外线敏感的嗜杀酵母(killer yeast)5174(α.radl ural[KIL-kd,crz^ro^r])菌株的嗜杀质粒转移到CD4—W中,并对5174菌株原生质体的形成及紫外线致死等条件进行了研究。 以PEG—6000作为融合促进剂,促使两种原生质体融合,获得的大量融合子经嗜杀活性检出实验、小型酿造实验、遗传稳定性实验、细胞形态及大小的测定、dsRNA质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳等实验,最终选出5株遗传性能稳定的融合子:FP3—13,FP3—28,FP5—23,FP5—24,FP9—3。对实验结果的进一步分析表明:融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5174的嗜杀质粒,而且还含有受体菌CD4—W良好的核基因,是遗传稳定的异质体。小型啤酒酿造实验表明:将融合子FP5—24用于啤酒酿造中,对于抵抗野生酵母的污染、净化发酵体系,保证啤酒纯种酿造的进行有明显效果。

电融合构建嗜杀啤酒酵母及其发酵性能的研究

以MK_2-3: K^+R^+leu^-ρ^+(n)为供体菌,AS2420-1: K^-P^-leu^+ρ~0(2n)为受体菌,通过电融合技术构建一批嗜杀啤酒酵母。其中4株融合子具有较高的嗜杀活性,对这4株融合子的遗传性状、DNA含量及细胞大小、形态,嗜杀质粒ds-RNA提取及电泳等研究表明,这4株菌具有双亲的互补性。对其中MAR_1的进一步实验表明,MAR_1的某些发酵性能接近甚至优于亲株AS2420-1,具有与亲株MK_2-3相同的杀菌谱,混合发酵实验中MAR_1可有效地防止野生酵母的污染,具有进一步开发利用的潜在价值。

嗜杀酿酒酵母毒素蛋白及其杀伤质粒的研究

Killer toxin from \%Saccharomyces cerevisiae\% SK was isolated by ultrafiltration of culture supernatants and purified by poly(ethylene glycol). The toxin migrates as one single protein band on SDS-PAGE and its molecular weight is 15kD. The SK toxin has the greatest lethal effect on the sensitive yeast strain in the lat lag phase. Extraction and purification of killer heretity factor(dsRNA) from SK found that M dsRNA plasmid and L dsRNA plasmid have different molecular lengths being 1.7kb and 4.0kb.

利用细胞质导入法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KD102菌株。对融合子分析表明:融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KD102菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验,结果表明,具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中,能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。

嗜杀酵母的生物学功能及其应用

嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白,杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀酵母的嗜杀特性与两种双链线状RNA(dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的M-dsRNA和编码自身和M-dsRNA外壳蛋白的L-dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度,造成ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀酵母可避免野生型酵母污染,净化发酵体系,改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物的抗真菌剂。

具有嗜杀质粒(killer plasmid)酵母菌嗜杀特性的初步研究

以K_2型嗜杀酵母为材料在改进Russell(1986)的嗜杀活性检测方法基础上,建立了双层平板单菌落检测法。此法可直接用于嗜杀酵母的筛选,嗜杀质粒的检测,并能在诱变后的平板上检出有嗜杀活性的营养缺陷型菌株MK_2-3:K^+,len。对K_2嗜杀特性初步研究表明,K_2型嗜杀酵母能杀死酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae),但对所测汉逊酵母(Hansenula spp.)无作用。嗜杀毒素产生的最适pH和温度分别为pH4.5—5.5和20—25℃,酵母菌的对数生长期嗜杀毒素达到高峰。用紫外线(UV)、溴化乙锭(EB)、亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)进行消除K因子实验,表明亚硝基胍和紫外线对K因子具有一定消除率,而溴化乙锭和甲基磺酸乙酯未发现消除作用。

鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达

目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载体 ,使两个目的基因均受各自的启动子 CMV控制 ,构建成 m IL - 12双亚基共表达质粒 p Cm IL -12 ,并进行体内外表达。结果 :p Cm IL - 12在体外转染 COS- 7细胞后 ,经 EL ISA证实有 m IL- 12表达 ,其表达上清能在体外明显增强小鼠 NK细胞活性。小鼠皮内注射 p Cm IL - 12亦能增强小鼠 NK细胞活性。结论 :所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的 m IL-

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性，两株嗜杀酵母具有相互杀死作用，其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb，两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失，消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失，嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同，最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃，但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。

杀伤啤酒酵母的构建及其发酵性能研究

运用原生质体融合及罕见交配法构建了一批具有杀伤性能之啤酒酵母。其中kSC-2m-2,KSC-2f-11具有与亲株相似的发酵性能。所生产的嫩啤酒经三杯品评未见明显差异,嫩啤酒杀菌活性在4℃下可维持4周以上,混合发酵试验表明,杀伤啤酒酵母可有效地防止野生酵母的污染。实验中同时发现大部分胞质融合株代谢性能改变。

酿酒酵母不同嗜杀菌株的比较及相互作用

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株ＳＫ４（Ｋ１型）和ＥＲＲ１（Ｋ２型）为材料，分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性．证明两株菌产生的毒素蛋白的最适条件不同，最适ｐＨ和温度分别为４．８、１６℃和４．２、２２℃，但均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著．ＳＫ４和ＥＲＲ１的嗜杀质粒的比较表明：Ｍ１－ｄｓＲＮＡ质粒和Ｍ２－ｄｓＲＮＡ质粒分子量分别为１．７ｋｂ和１．５ｋｂ，两株菌的Ｌ－ｄｓＲＮＡ质粒均为４．０ｋｂ．用高温和紫外线处理嗜杀酵母，嗜杀活性随之消失．

酵母嗜杀质粒融合转移──Ⅰ．融合转移系统的建立

以嗜杀酵母ＥＲＲ１和啤酒生产酵母ＡＳ２４２０出发菌株，建立了供体菌ＭＫ２－３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－ρ＋（ｎ）和受体菌ＡＳ２４２０－１：Ｋ－Ｒ－ｌｅｕ＋ρ°（２ｎ）．对原生质体制备再生条件的研究结果表明两株菌的原生质体制备条件不尽相同；同一菌株原生质体形成与再生的最佳条件也不相同．有利于融合再生的原生质体制备条件是ＭＫ２－３：菌龄３０ｈ，蜗牛酶解量３０ｇ／Ｌ酶解时间３０ｍｉｎ，此时原生质体形成率为８０％，而再生率达１７．１％，这些条件对嗜杀活性无影响，再生菌落的嗜杀活性率达１００％；而ＡＳ２４２０－１；菌龄２４ｈ，蜗牛酶量２０ｇ／Ｌ，酶解时间３０ｍｉｎ，原生质体形成率为８１％，再生率为１８．１％．对四种渗透压稳定剂的再生效果实验表明甘露醇效果最佳，氯化钾次之，考虑到廉价，氯化钾是很好的代用品，在３０％ＰＥＧ６０００及Ｃａ２＋条件下进行原生质体融合，融合率可达８．９×１０－６，对其中的融合子ＭＡＲ４的遗传性状及嗜杀活性的稳定性检测，ＤＮＡ含量及细胞大小测定，ｄｓＲＮＡ质粒的提取及电泳结果分析和发酵性能测定，结果表明融合子ＭＡＲ４具有较高的嗜杀活性并可以稳定遗传，有与供体菌ＭＫ２－３嗜杀质粒ｄｓＲＮＡ相同的电泳行为，?