Detection of Kinetoplast DNA From Trypanosoma evansi by PCR

Trypanosoma evansi, an economically important haemoflagellate, infects many domestic and wild animals such as horses, camels, buffalo and deer, causing the trypanosomiasis called surra in these animals. This parasite has an extremely wide geographical distribution in the continents of Asia, Africa and South America. Surra is also one of the most important endemic diseases of animals in China, especially

直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。

伊氏锥虫和布氏锥虫动基体DNA酶切电泳比较

限制性内切酶ＭｂｏＩ、ＤｄｅＩ、ＨｉｎｆＩ和ＴａｑＩ对市氏锥虫ＫＤＮＡ进行酶切后，电泳中均显示出多条ＤＮＡ区带，其总Ｋｂ数约等于２０ｋｂ，内各限制酶对伊氏锥虫ＫＤＮＡ消化后均显示出１至２条区带，总和约１ｋｂ，明显区别于布氏锥虫。

伊氏锥虫动基体DNA微环的研究

采用限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳及分子杂交技术对８株中国伊氏锥虫动基体ＤＮＡ（ｋＤＮＡ）微环进行了比较研究。结果显示，我国伊氏锥虫株之间的ｋＤＮＡ微环序列具有较高的同源性，仅限制酶 ＡｌｕＩ，ＨｉｎｆＩ及 ＭｂｏＩ的酶解结果显示少数虫株的 ｋＤＮＡ微环存在异源序列。这种异源性可以作为伊氏锥虫种内分类的遗传学标志。

伊氏锥虫动基体DNA序列比较

对伊氏锥虫新疆骆驼株（ＸＪＣＡ）、安徽水牛株（ＡＨＢ）和云南水牛株（ＹＮＢ）的动基体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后，用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧核糖核酸法测定扩增产物的序列。结果表明，各虫株间ＤＮＡ序列同源性为９７％。内聚分析表明，ＡＨＢ株与ＸＪＣＡ株相似性高属一类，而ＹＮＢ株与中国伊氏锥虫ＳＨ株相似性高属另一类。证明我国不同伊氏锥虫在动基ＤＮＡ序列上存在一些差别，这可能由于点突变的缘故。

砂鼠利什曼原虫(Leishmania gerbilli)的亚显微结构

砂鼠利什曼原虫(Leishmania gerbilli)存在于我国西北甘肃某地的砂土鼠或大砂鼠(Rhombomys opimus)体内,是中国特有的种类,王捷等60年代分离培养成功。对L.gerbilli的前鞭毛体的亚显微结构的观察表明:1.质膜下微管间距约为50nm,比别的利什曼原虫的宽;2.鞭毛基部极少观察到基板(basal plate);3.线粒体发达,从动基体所在部位伸向虫体各个部位,内有复杂的结构;4.在通常情况下,L.gerbilli的动基体呈棒状,但当细胞膨胀后则无论在光镜或电镜下动基体均呈扁环结构;5.虫体后部有发达的复片层结构。这一结构由一系列的膜卷绕成,其意义不明。

皮肤组织印迹杂交法诊断犬利什曼病研究初报

用利什曼病原虫KDNA印迹杂交法对采自甘肃省文县黑热病流行区的30只家犬耳缘皮肤组织印迹样品进行杂交试验。结果30份犬样品中有8份呈现阳性反应,阳性率为26.7％。同时进行骨髓涂片检查,有5只犬查见原虫,阳性率为16.7％。以上两种方法的符合率达76.7％(23/30)。印迹杂交法具有特异性高,取材方便,快速和结果易于观察等优点,在诊断犬利什曼病中有一定应用前途。

黑热病2例误诊分析

黑热病的误诊率非常高,误诊原因复杂。该文通过复习相关文献,结合该院新近诊断的2例黑热病的诊断体会及患者的骨髓象特点,对黑热病的误诊情况进行分析,提出黑热病与常见误诊疾病的鉴别方法,以期降低黑热病的误诊率。

PCR扩增技术用于犬内脏利什曼病病原体kDNA的检测

本文报导了用作者设计的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ以及文献报导的一对引物A、B检测内脏利什曼病病犬的骨髓、脾和外周血内的病原体kDNA,并和骨髓涂片检查利什曼原虫的结果进行了比较。共检测人工感染犬12只,骨髓涂片阳性者8例,其中PCR检测骨髓组织样品阳性者7例,检测脾组织样品阳性者3例;对照组犬脾、骨髓和外周血所有组织样品均为阴性。根据实验结果认为此法用于检测犬内脏利什曼病病原体kDNA有较好的效果。

黑热病11例临床误诊分析

目的降低黑热病的误诊率。方法回顾性分析我院2008年8月～2012年6月共误诊黑热病11例临床特点及实验室资料,对其误诊结果进行总结。结果 11例中有血液性疾病4例,呼吸系统疾病5例,消化系统疾病2例收入院治疗,平均5.5d后通过骨髓穿刺明确诊断。结论骨髓穿刺找到动基体是识别利杜体避免误诊的关键,而利杜体在瑞氏-姬姆萨染色中比单纯瑞氏染色、糖原染色等着色更清晰、更易辨认。

微生物线粒体衍生细胞器及产氢体研究进展

对线粒体衍生细胞器的动基体、线性体和隐性体以及产氢体的形态、结构、功能和起源等方面进行了综述,并总结了近十年来线粒体衍生细胞器及产氢体的研究进展.

克氏锥虫的超微结构

从感染克氏锥虫的小鼠切取病变心肌组织,同时取培养的锥虫作电镜观察。结果显示:无鞭毛体圆或椭圆形。鞭毛袋内藏鞭毛。无鞭毛体的鞭毛较短,大都藏于袋内。在鞭毛横切面上,周围有9对微管,中央有2根微管。质膜下有排列整齐的膜下微管,约143根。动基体腊肠状,内腔中含有呈“8”字形紧密排列的DNA纤丝。高尔基复合体呈囊状。在小鼠心肌纤维中,常可见簇状排列的无鞭毛体。锥鞭毛体的动基体在核后方,动基体的DNA由平行而疏松排列的纤丝组成。动基体DNA纤丝在无鞭毛体及锥鞭毛体内形态显著不同。阐明这种形态变化的本质,对揭示动基体功能将起重要作用。

伊氏锥虫动基体株与无动基体株致病力比较研究

以大家畜和小鼠感染试验比较了我国南、北两大疫区伊氏锥虫株及南方疫区动基体株和无动基体株的致病力。结果显示，感染南方疫区动基体株和无动基体株的马属动物和牛的临床及血检变化极为相似，感染后者的小鼠平均存活时间比感染前者的长１６ｈ，但两虫株致病力无明显统计学差异。感染北方疫区动基体株小鼠的平均存活时间比感染南方株的长，与感染南方疫区动基体株组间差异显著（Ｐ＜０．０５），与无动基体株组间差异极显著（Ｐ＜０．０１）。提示北方疫区虫株致病力弱于南方疫区虫株。

我国不同流行区利什曼原虫分离株动基体小环DNA序列分析

目的分析我国不同流行区利什曼原虫动基体小环DNA序列差异性。方法应用来自小环DNA保守区的一对引物KP1-KP2扩增该利什曼原虫动基体小环DNA,将扩增产物克隆于pGEM-T载体,随机选取5个阳性克隆进行双向测序,对获得的小环序列应用DNAStar软件进行比对分析,并利用Mega5.0构建系统进化树。结果应用KP1-KP2引物分别从来自我国不同流行区利什曼原虫虫株SC、KXG-Xu、KXG-65、JIASHI-1和801扩增出单一小环序列,长度分别为858bp,858bp,858bp,750bp和748bp。SC、KXG-Xu和KXG-65间序列一致性超过99%,JIASHI-1和801虫株序列均与其它虫株显示高度异质性。进化分析显示801与一杜氏利什曼原虫聚为一类,JIASHI-1与亲内脏的利什曼原虫聚为一大类,而SC、KXG-Xu和KXG-65三者聚为独自一类,和亲皮肤的利什曼原虫相比,与亲内脏的利什曼原虫有更近的亲缘关系。结论我国不同流行区利什曼原虫虫株小环序列存在较大差异性。

砂鼠利什曼原虫(Leishmania gerbilli)染色质与动基体碱性蛋白的初步研究

利用纯化的砂鼠利什曼原虫细胞核作为起始材料对其染色质碱性蛋白进行分析,发现这类生物中只存在四种核芯组蛋白(H_(4),H_(2)A,H_(2)B和H_(3))。 用凝胶电泳比较全细胞的与细胞核的碱性蛋白时,检出了一种来自细胞质的酸溶性蛋白(L组分)。细胞化学的检测表明它定位于动基体(Kinetoplast)。

马疫锥虫动基体DNA诱导抗dsDNA抗体产生条件与致病性的研究

目的研究不同免疫途径对马疫锥虫动基体DNA(kDNA)诱导正常小鼠产生抗双链DNA(dsDNA)抗体及其致病性的影响。方法将马疫锥虫kDNA与不完全弗氏佐剂乳化混合,通过皮下、腹腔、肌肉及静脉等途径注射入正常BALB/C小鼠。8周后,检测小鼠血清抗dsDNA抗体亚型及滴度、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、补体C3、24h尿蛋白浓度、肾小球免疫复合物沉积强度、肾组织病变活动指数等,并分析肾组织病理学特征。结果上述各组小鼠产生IgG型抗dsDNA抗体量及肾损害程度依次为:皮下组>腹腔组>肌肉组>静脉组(P<0.05);IgG型抗dsDNA抗体与肾组织病变活动指数呈正相关。结论不同免疫途径对马疫锥虫kDNA诱导抗dsDNA抗体产生有明显不同影响,其导致的狼疮样肾脏损害与该抗体亚型有关。

黑热病的临床诊断与鉴别

目的降低黑热病的误诊率。方法分析2例黑热病确诊病例的临床资料及骨髓中利杜体的形态特点及分布。结果瑞氏-姬姆萨染色骨髓中的利杜体可见1个较大染紫红色的类圆形核,还可见1个比核明显小的呈棒状的动基体;动基体染紫红色,着色明显比核深且结构致密,动基体可在利杜体的任何位置出现,在其中的某些位置也许不甚清楚,但在整张骨髓片中会有大量利杜体可见典型的动基体;利杜体可散在或成簇存在,分布于吞噬细胞内外,位于吞噬细胞内的利杜体更易辨认。结论找到动基体是识别利杜体避免误诊的关键,而利杜体在瑞氏-姬姆萨染色中比单纯瑞氏染色、糖原染色等着色更清晰、更易辨认。

无症状感染利什曼原虫快速分子检测方法的建立与应用

目的建立适合快速检测利什曼原虫无症状感染者的分子生物学方法。方法选择利什曼原虫k DNA小环保守区的2对快速诊断特异性引物RV1-RV2、K13A-K13B,以杜氏利什曼原虫山东分离株前鞭毛体抽提的k DNA为模板进行PCR扩增,并通过对扩增条带测序比对来鉴定方法的可靠性。运用该法对四川省黑水县105例无症状家犬和新疆喀什地区部分乡镇75例无症状易感人群的静脉血样进行检测,并同时对上述地区确诊的部分病犬及病人(均为7例)进行检测,以验证该方法的可行性及准确性。结果 RV1-RV2、K13A-K13B两对引物扩增出与预期片段大小一致的条带,序列比对结果显示扩增产物在利什曼原虫种内保守性高;该方法对105例无症状家犬及75例无症状居民静脉血样的阳性检出率分别为37.14%(39/105)和82.67%(62/75),且对同地区确诊病犬及病人血样本检测的阳性率均为100%(7/7)。结论该方法适于目前我国黑热病流行区利什曼原虫无症状感染者的检测,且灵敏快速准确,具有较好的推广应用价值。

检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR的建立及应用

建立一种快速准确检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。以利什曼原虫动基体小环保守序列为靶基因,设计1对特异性引物和Taq-Man探针,以利什曼原虫阳性患者骨髓样品DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物长83 bp。扩增产物连接至pESI-T载体进行克隆、测序,测序结果在GenBank上进行BLAST比对,结果显示,其序列与婴儿利什曼原虫和杜氏利什曼原虫的序列一致性为100%。取测序正确的质粒梯度稀释至10^(2)~10^(7)拷贝/μl作为标准品进行qPCR,绘制获得标准曲线方程y=39.23-2.956 x,扩增效率为117.93%,R^(2)为0.994;当阈值循环数为35时,最低检测限为26.98拷贝/μl,理论上可检出小于1个利什曼原虫。用所建立的qPCR检测内脏利什曼病患者骨髓样品14份、血样26份,利什曼病病犬的骨髓、血液、脾、肺、淋巴结、肝、肾组织样品各1份,利什曼原虫阳性白蛉2份,患者和病犬骨髓培养物各1份,结果均为阳性;检测利什曼原虫血清抗体阳性犬骨髓9份,结果7份阳性;检测利什曼原虫血清抗体阴性人群血样56份,沙门菌、志贺菌、蜡样芽胞杆菌DNA各1份,疟疾患者血样4份,刚地弓形虫病患者血样、卫氏并殖吸虫病患者血样各1份,结果均为阴性。所建立的qPCR具有较高灵敏度及特异度,可用于利什曼病患者、宿主动物、传播媒介利什曼原虫感染与带虫状态的快速检测,可用于患者的疗效判定。

核糖体小亚基RNA和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ基因在中国利什曼原虫系统发育学分析中应用的比较

目的比较核糖体小亚基RNA（small subunit ribosomal RNA．SSUrRNA）和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ（cytochrome oxidaseⅡ，COXⅡ）这2种分子标志在中国利什曼原虫系统发育学分析中的不同。方法提取利什曼原虫各虫株核基因组和线粒体基因组．PCR方法扩增中国不同地区利什曼原虫SSUrRNA和COXⅡ基因．扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序．序列碱基通过Clustal X软件比对，用DAMBE软件进行单倍型分析、Mega4软件计算遗传距离，Mrbayes3．1．2软件构建贝叶斯进化树。结果COXⅡ分析结果表明．流行于中国的利什曼原虫虫株未形成一个单系群：GS7和XJ771属于杜氏利什曼原虫复合体；10株利什曼原虫形成的6个单倍型（MHOM／CN/93/GS7,IPHL／CN／77／XJ771,MHOM／CN／84／JS1和MGER／CN／60／GS．GER20除外）形成1个单系群：而SSUrRNA分析结果表明：11株利什曼原虫（IPHL／CN／77／XJ771，MHOM/CN，93／GS7，MRH0／CN／88／KXG-2，MHOM／CN／84／JS1．MGER／CN／60／GS．GER20除外）形成一个独立枝；江苏株JS1和热带利什曼原虫聚在一起，不与杜氏利什曼原虫聚在一起。结论SSUrRNA和COXⅡ得出的结果较一致．但COXⅡ基因在分析利什曼原虫的系统发育关系时．可能是一个更可靠的遗传标志。