兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法,本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因,设计2对特异性引物进行双重PCR扩增,经反应条件优化,建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃,最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强,对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性,对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性,对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高,对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10^(3)拷贝/μL和1×10^(4)拷贝/μL。该方法重复性好,且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性,且重复性好、准确性高,为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。

牛荚膜血清A型巴氏杆菌病的分子流行病学调查

本研究针对多杀性巴氏杆菌(Pm)特异性基因kmt1,进化保守基因16S rRNA基因,以及荚膜血清型A、B、D、E和F型对应的荚膜生物合成基因hayD-hayC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,设计特异性PCR扩增引物,采用PCR方法扩增相应基因和进行序列测定,并对分离菌株进行分子鉴定和同源性分析。结果显示,来自不同地区的分离菌株均含有Pm种特异性基因kmt1、A型荚膜生物合成基因hayD-hayC和16S rRNA基因。不同地区的分离株,kmt1基因的同源性为100%;A型荚膜生物合成基因hayD-hayC同源性大于99.9%;与国外牛源分离株的hayD-hayC基因的同源性大于98%;不同地区分离株的16S rRNA基因的同源性为100%,而与英国牛源分离株Pm338的16S rRNA基因的同源性高达99.93%。这些结果表明,在我国6个省市流行的牛出血性败血症由同一来源的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致,与英国牛源A型分离株Pm338具有共同的进化来源。

产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。

兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L^(−1)。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×10^(3)拷贝·μL^(−1),敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。

羊源多杀性巴氏杆菌重组酶聚合酶扩增诊断方法的建立

为建立适用于羊源多杀性巴氏杆菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)诊断方法,本研究依据前期测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建pET-28a(+)-KMT1质粒标准品。设计基于RPA技术的特异性引物及RPA荧光探针,建立实时荧光RPA方法的最适反应体系。采用10倍梯度连续稀释的质粒标准品检测该RPA方法的敏感性并绘制相关性曲线;以10种不同菌株的基因组DNA为模板验证方法的特异性;用感染多杀性巴氏杆菌的山羊及小鼠组织样品对方法的可靠性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光RPA方法最适反应温度为39℃,最佳引物为KMT1-Fe1,灵敏度达100拷贝/μL,检测下限为10拷贝/μL。与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、产酸克雷伯菌、布鲁氏菌S2株和鲍曼不动杆菌均无交叉反应。对13个组织样本进行检测,阳性率为76.9%,与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述,本研究建立的羊源多杀性巴氏杆菌实时荧光RPA方法具有特异性强、灵敏度高、可靠、快速便捷等特点,适用于多杀性巴氏杆菌的临床分子诊断。

青藏高原犬源多杀性巴氏杆菌种特异性KMT1基因的克隆与序列分析

为了研究青藏高原犬源多杀性巴氏杆菌（Pm）的KMT1基因与其他茵株的分子进化关系，试验采用PCR方法扩增了1株犬源Pm分离株P1202的种特异性KMTl基因，然后将获得的460bp的目的基因片段连接到pMD18一T载体上，进行PmKMTl基因的克隆及序列分析。结果表明：分离株KMT1基因编码区核苷酸序列与GenBank中发表的12株国内外Pm分离株的KMT1基因序列同源性为39％～72％。P1202株与FJ986389序列的同源性最高，为72％，说明二者进化途径较近，而与AY225344、AY225345、AY225346、AY225347序列的同源性较低，说明它们之间进化途径较远。

牛源多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立与应用

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10~5,1.98×10~6 copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测手段,具有一定的临床应用价值。

鹿源多杀性巴氏杆菌的鉴定、分型及生物学特性分析

为了对新疆南疆某鹿场疑似感染多杀性巴氏杆菌的死亡马鹿肺脏样本中的分离菌株进行鉴定、分型及生物学特性分析,试验首先采用染色法和生化鉴定初步判定分离菌株的种类,然后通过PCR扩增分离菌株的16S rRNA基因、Kmt1基因、荚膜血清分型基因和LPS基因,进一步对分离菌株进行鉴定和分型,最后对分离菌株进行遗传进化分析和药敏试验。结果表明:分离菌株为荚膜血清D型、LPS基因L3型多杀性巴氏杆菌;该分离株的16S rRNA基因序列与多杀性巴氏杆菌参考株DY120818、GDZQ201401、PM-LK、PM-R1601、4085、FUP12、PM30、PM75、Tabriz31、Tabriz61的核苷酸序列相似性在99.9%~100%之间,Kmt1基因序列与多杀性巴氏杆菌参考株CSWRI-AH-PmAg16、HaiNGoosePm2012、Jhakhrana、M14、OND Duck、PMI030、PMUEL 1-BR-11、SichuanPm2014、VRI-Pm2的核苷酸序列相似性在94.9%~99.5%之间,荚膜血清分型基因与同为荚膜血清D型的多杀性巴氏杆菌参考株CSWRI-AH-PmD16、P934和P-4058的核苷酸序列相似性在97.4%~97.9%之间,LPS基因序列与同为L3型的多杀性巴氏杆菌参考株KF314826.1、P1059、P1662的核苷酸序列相似性在87.4%~98.6%之间。该分离株对头孢唑啉、新霉素、头孢曲松和氨苄西林高度敏感,对氯霉素、庆大霉素、卡那霉素和诺氟沙星中度敏感,对克林霉素耐药。说明试验成功分离出一株鹿源多杀性巴氏杆菌。