Knockout血清替代品可提高C57BL/6J小鼠胚胎干细胞建系效率

目的:在培养液中添加knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)代替胎牛血清(FBS)用于建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞(ESC)细胞系,以便消除血清中的不确定因子对ESC增殖的影响。方法:以C57BL/6J小鼠3.5 d的囊胚为材料分离ESC,比较KSR和FBS用于建立小鼠ESC细胞系的效率,并通过体内、外分化验证所分离获得的小鼠ESC的发育潜能。结果:培养液中添加KSR,成功从13个小鼠囊胚中分离获得一个ESC细胞系(MES-1),体外培养传代超过20代仍保持未分化状态,核型为正常XX型,碱性磷酸酶及oct-4基因高表达,悬浮培养可以生成拟胚体,接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤,注射到ICR小鼠3.5 d囊胚中,ESC可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。而培养液中添加FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。结论:在培养液中添加KSR代替FBS适合于C57BL/6J小鼠ESC的分离与培养,从而可避免实验前对所用血清的筛选。

用KOSR优化山羊克隆胚的培养体系

体细胞核移植重构胚的体外培养一直是影响山羊克隆效率的一个重要因素,为了排除成分复杂的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)对克隆重构胚发育的潜在抑制作用,本研究采用成分明确的血清替代品(knockout serum replacement,KOSR)进行山羊体细胞克隆重构胚胎的体外培养,并比较KOSR与FBS对重构胚的发育效率的影响。结果显示,KOSR组山羊重构胚培养体系的分裂率明显高于FBS组(80.67±0.63%.vs 49.02±4.85%,P<0.01),2组在重构胚重编程过程中的8细胞率具有显著差异(48.89±1.92%vs.28.59±3.13%,P<0.05);2组不同培养体系的受孕率也有明显不同(33.3%vs.10%,P<0.05)。研究结果表明,KOSR培养体系能有效提高山羊重构胚的发育效率,特别是有利于重构胚的早期重编程,为获得健康的转基因克隆山羊奠定了良好的基础。

不同培养体系对绵羊类胚胎干细胞分离、传代的影响

以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,研究了用Knockout血清替代品(Knockout serum replacement,KSR)代替胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES cell)培养液中的胎牛血清(FBS)和向含KSR的基础培养液中添加40%的小鼠ES细胞条件培养液(ES cell conditioned medium,ESCCM)对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响。发现使用含FBS的基础培养液最多可以把绵羊类ES细胞传至3代,而使用KSR和添加ESCCM能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆,所获得的类ES细胞分别可稳定传至第5和8代。同时对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征。由此认为,与FBS相比KSR更加适于绵羊类ES细胞的分离与培养;而小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增值的作用。

无bFGF条件下简便有效建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系

目的:在不含bFGF的Knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)的培养条件下,简便、有效地建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)系。方法:以C57BL/6J小鼠3.5天囊胚为材料,改良巴氏德管机械法分离内细胞团,于加或不加碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、含KSR的ES培养基中进行培养和建系,并对建立的小鼠ES系进行鉴定,包括碱性磷酸酶、表面标记分子SSEA-1和多能性相关因子(Oct4、Sox2和Nanog)的检测,核型分析,体内外分化能力等。结果:在无bFGF的ES培养条件,成功从6个小鼠囊胚中分离和建立4株ES系;而添加10 ng/ml bFGF的ES培养条件下,3个优质囊胚未见ES样克隆出现。所建立的小鼠ES可长期传代并维持未分化状态,体内外分化能形成3个胚层结构。结论:辅以改良机械法分离内细胞团,无bFGF的KSR培养条件有助于高效建立C57BL/6J小鼠ES系。

兔原始生殖细胞(PGCs)体外培养和生物学特性

为了探究兔原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)体外培养的生物学特性及胎龄、维甲酸(retinoic acid RA)、福司柯林(forskolin, FK)、4-羟基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen, 4OHT)、血清(FBS)和血清替代物(KSR)对PGCs分离培养的影响,本试验从E10.5~E15.5的胎兔生殖嵴中分离PGCs,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AKP)染色、RT-PCR等方法对其进行鉴定。在基础培养液中分别添加RA、FK、4OHT、FBS和KSR,结果表明,兔PGCs可以重编程为生殖干细胞(embryonic germ cells, EGCs),EGCs可分化为神经样细胞、上皮样细胞和拟胚体;从E10.5和E11.5的胎兔生殖嵴中分离的PGCs,体外培养增殖能力较强;基础培养液中同时添加RA、FK和4OHT时PGCs的集落数量较多,形态特征和细胞活性较好;培养液中加入KSR时,PGCs集落数量较多,形态特征较好。