纤溶酶Kringle区缺失突变体对兔眼玻璃体视网膜界面的作用

目的研究纤溶酶Kringle区缺失突变体(Plm△K)对兔眼玻璃体视网膜界面的作用。方法Plm△K由毕赤酵母表达的纤溶酶原Kringle区缺失突变体(Plg△K)经组织纤溶酶原激活剂(tPA)激活产生,并通过发色底物S2403测定其蛋白水解活性。0.5、1.0、1.5μmol/min Plm△K100μL分别注入16只新西兰白兔的玻璃体腔内,注射后1d、7d在光镜下和扫描电镜下检查,并行大体检查、眼部B型超声和光学相干断层扫描(OCT)检查,观察玻璃体视网膜界面情况。结果还原性SDS-PAGE凝胶成像分析证实,Plg△K被激活后产生相对分子质量约26000和5000的2条肽链,且具有纤溶酶活性。4种检测结果均显示Plm△K诱导玻璃体皮质与视网膜的分离。视网膜内表面皮质残留量与Plm△K的剂量呈负相关(r=-0.9516,P=0.048),完全性分离可产生光滑的视网膜内表面。Plm△K注射眼与对照眼的视网膜外层结构均未发现明显的差异。视网膜内表面皮质残留量与药物作用时间有一定的关系,但差异无统计学意义(r=-0.720,P=0.470)。对照组和Plm△K处理组间视网膜外层的形态学无明显不同。Plm△K玻璃体注射后未发现视网膜发生药物相关的不良反应。结论玻璃体腔单独注射Plm△K可有效诱导玻璃体与视网膜的完全性分离,而对外层视网膜结构无明显影响。

人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定

目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体（PLGAK）的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7．5L发酵罐对工程菌PLG△K／GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLG△K等电点、纯度和分子量；纤维蛋白平板、肽底物S-2403分别测定PLG△K激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果7．5L高密度发酵可获得约为400mg／L培液的表达量，经三步纯化后制备的PLG△K纯度大于96％。理化分析显示PLG△K的等电点为7．5～7．8，分子量：27．787kD，比活性：23．6U／mg。结论初步建立了PLG△K的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。

t-PA K1区的同源模建及Kringle区与赖氨酸相互作用的研究

利用同源模建方法预测了t-PAK1区的三维结构。通过结构叠合确定了t-PAK1、K2区,纤溶酶原K1、K4区及UKK区的赖氨酸结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明,在t-PAK2区以及纤溶酶原K1、K4区与纤维蛋白裸露的赖氨酸之间存在明显的静电势互补和疏水面契合。确定了影响Kringle区结合口袋与赖氨酸亲和的重要氨基酸,分析了t-PAK1区、UKK区不能结合赖氨酸的原因,由此设计了具有赖氨酸亲和力的新型t-PAK1区及UKK区突变体。利用模拟残基突变技术预测了突变体的结构变化,分析了突变后t-PAK1区及UKK区与赖氨酸亲和力的变化,初步在理论上肯定了设计方案的合理性。

t-PA K1区的同源模建及Kringle区与Lysine相互作用的研究

利用同源模建方法预测了ｔＰＡＫ１区的三维结构。通过结构叠合确定了ｔＰＡＫ１、Ｋ２区，纤溶酶原Ｋ１、Ｋ４区及ＵＫＫ区的Ｌｙｓｉｎｅ结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明，在ｔＰＡＫ２区以及纤溶酶原Ｋ１、Ｋ４区与纤维蛋白裸露的Ｌｙｓｉｎｅ之间存在明显的静电势互补和疏水面契合。确定了影响Ｋｒｉｎｇｌｅ区结合口袋与Ｌｙｓｉｎｅ亲和的重要氨基酸，分析了ｔＰＡＫ１区、ＵＫＫ区不能结合Ｌｙｓｉｎｅ的原因，由此设计了具有Ｌｙｓｉｎｅ亲和力的新型ｔＰＡＫ１区及ＵＫＫ区突变体。利用模拟残基突变技术预测了突变体的结构变化，分析了突变后ｔＰＡＫ１区及ＵＫＫ区与Ｌｙｓｉｎｅ亲和力的变化，初步在理论上肯定了设计方案的合理性。

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白的528%.

重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。