人源性纤溶酶原Kringle5基因杆状病毒表达载体构建及蛋白表达纯化

目的构建重组人源性纤溶酶原Kringle5（rhK5）杆状病毒表达载体并进行真核表达。方法采用bac-to—bac杆状病毒表达系统制备杆状病毒Bacmid—rhK5，感染草地贪夜蛾卵巢细胞sf21昆虫细胞，经Westernblot确定rhK5在sf21细胞中的表达方式和表达量。用血管内皮细胞抑制实验检测纯化蛋白活性。结果杆状病毒表达载体pFastBacHTB-rhK5构建成功，Westernblot检测发现，rhK5在sf21细胞中呈胞内表达，纯化后重组蛋白的产量约为90μg／L。血管内皮细胞抑制实验显示，半数有效剂量（ED50）为4μg／mL。结论rhK5杆状病毒表达载体于悬浮培养的sf21细胞中高效表达，为大量表达更接近天然的具有生物学活性的rhK5蛋白奠定了基础。

重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响

目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养;按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组;聚合酶链反应(PCR),MTT法对各组进行细胞活力测定;荧光显微镜照相。结果:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用,实验组与对照组比较P<0.01,实验组与空白对照组比较P>0.05;腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响,实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P>0.05。结论:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。

Kringle5基因的克隆、原核表达载体构建和蛋白表达

目的寻求一条高效且快速获得kingle5蛋白的途径.方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出kringle5基因,构建出原核表达载体pGEX-5X-1/kringle5,运用工程菌表达蛋白.结果测序表明kringle5基因与GenBank上报道的基因序列相同,并成功表达出kringle5融合蛋白.结论成功构建了人原核表达载体(pGEX-5X-1/kringle5),为获得抗肿瘤药物kringle5提供了一种切实可行的途径,为实体瘤的抗血管生成治疗研究奠定了初步基础.

Kringle5基因的表达、纯化及其抗膀胱肿瘤作用的初步研究

目的获得高纯度并且有活性的K5蛋白.方法继构建了重组质粒pGEX-5X-1-K5的基础上,转化感受态细胞BL-21、DH-5α、Top10,并优化了表达条件,经过裂解、洗涤、溶解包涵体后,用带GST标签的谷胱甘肽琼脂糖4B亲和柱进行纯化,Bradford法测蛋白浓度,分别用ECV304细胞和裸鼠皮下移植瘤模型对蛋白进行了活性测定.结果获得了表达量最高的条件:BL21感受态细胞,诱导时间:6 h,纯化后的K5蛋白纯度达到95%以上,K5浓度为5μg/mL时抑制率最高.裸鼠模型上,K5组肿瘤的生长速度明显慢于PBS对照.结论含有GST的融合蛋白表达载体,表达量多、易于纯化、成本低、蛋白纯度高,并能有效的抑制ECV304细胞,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,为K5的工业化大规模生产奠定了基础.

人膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定

目的构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性。方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白。带谷胱甘肽(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白,CellTiter96AQueous细胞增殖检测法(MTS)检测K5对ECV304增殖影响。结果 PCR扩增得到282bp片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下工程菌表达了特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12kD的K5蛋白;K5蛋白能特异性抑制ECV304增殖,抑制率最高蛋白浓度为5ng/L。结论含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量多且易纯化,为包括肿瘤在内的病理性血管增生疾病抗血管生成药物开发做了积极的尝试。

膀胱癌组织Kringle5基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

Krigle 5（K5）是纤溶酶原裂解片段，生物活性高于内皮抑素和血管抑素，其相对分子质量小、穿透力强，是更有研究前途的内源性血管生成抑制因子。本研究旨在对膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定。

梅花鹿DLX5基因克隆及表达分析

为研究梅花鹿(Cervus nippon)DLX5基因的结构和功能,进一步探究其与梅花鹿茸角骨化机制间的关系,采用RT-PCR技术对梅花鹿DLX5基因进行克隆,获得包含全部编码区的c DNA序列,对该基因的氨基酸序列进行生物信息学分析并构建系统进化树,通过KEGG富集分析其信号通路,运用实时荧光定量RT-PCR检测该基因在鹿茸生长不同时期的表达情况。结果表明:梅花鹿DLX5基因编码区长为870 bp,共编码289个氨基酸。DLX5蛋白为可溶性的不稳定蛋白,有2个保守结构域,主要定位于细胞核。梅花鹿DLX5蛋白与许多不同物种来源的DLX5蛋白氨基酸序列有较高相似度,比较保守。DLX5蛋白二级结构中无规则卷曲占比最大(78.89%),其后依次是α-螺旋、延伸链,占比分别为16.96%和4.15%。DLX5基因主要的作用通路为TGFβ信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路等。实时荧光定量RT-PCR结果表明,DLX5基因在鹿茸生长后期(三杈茸)表达量显著增高,这种上调表达暗示了其在鹿茸骨化过程中发挥重要作用,说明其可能是鹿茸骨化相关候选基因。

单纯型大疱性表皮松解症患儿的角蛋白5基因突变研究

目的:对1例单纯型大疱性表皮松解症(EBS)患儿及其家系进行基因突变检测和致病性分析。方法:应用高通量二代测序技术捕获目标序列,对患儿进行全外显子组测序。发现致病位点后,应用Sanger测序法进行家系验证,查阅人类基因突变数据库(HGMD),运用生物信息学蛋白功能预测软件,分析变异位点的致病性。结果:患儿角蛋白5(KRT5)基因的第一外显子检出杂合变异c.536T>C(p.F179S),该变异造成KRT5蛋白的第179位氨基酸改变,患儿父母均未检测到相同突变。结论:患儿KRT5基因的杂合变异c.536T>C(p.F179S)为新发致病性变异,导致患儿KRT5缺陷,进而引发疱疹样型EBS(DM-EBS)。该变异位点在国内未见报道,扩大了我国人群KRT5的基因突变谱,为家系的遗传咨询和产前诊断提供依据。

CYP2D6、CYP2C19、CYP2B6、SLC6A4、HTR2A基因型和5-羟色胺再摄取抑制剂抗抑郁药:2023年CPIC指南解读

2023年临床药物基因组学实施联盟(CPIC)更新并扩展了2015年CYP2D6和CYP2C19基因型与选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)治疗指南,在涉及基因型与药物部分分别增加了CYP2B6、5-羟色胺转运体SLC6A4、5-羟色胺2A受体HTR2A以及5-羟色胺与去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs)、类SSRIs活性的5-羟色胺(5-HT)调节剂相关内容,并更新了基于基因多态性的5-HT再摄取抑制剂类药物应用建议。本文对该指南相关内容进行解读,以期为我国5-HT再摄取抑制剂类药物个体化药物管理提供参考。

同源异型盒基因A5、三结构域蛋白14与结直肠癌的关系

目的探讨结直肠癌组织同源异型盒基因A5(HOXA5)、三结构域蛋白14(TRIM14)蛋白表达水平与临床病理特征及患者预后的关系。方法回顾性收集整理2016年5月至2018年5月期间于河南中医药大学郑州人民医院确诊的120例结直肠癌患者癌组织及癌旁组织标本及相关临床资料,采用免疫组化法检测组织HOXA5、TRIM14蛋白表达水平;分析HOXA5、TRIM14水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系;采用Kaplan-Meier法分析组织中HOXA5、TRIM14表达与结直肠癌5年生存率的关系;采用Cox比例风险回归模型分析结直肠癌5年预后影响因素。结果结直肠癌组织中TRIM14蛋白阳性率为73.33%,明显高于癌旁组织的10.00%,HOXA5蛋白阳性率为27.50%,明显低于癌旁组织的81.67%,差异均有统计学意义(P<0.05)。TRIM1蛋白阳性表达患者肿瘤低分化比例为42.05%,浸润深度T_(3)~T_(4)比例为72.73%,有淋巴结转移比例为47.73%,有远处转移比例为29.55%,明显高于TRIM1蛋白阴性表达的12.50%、37.50%、12.50%、6.25%,差异均有统计学意义(P<0.05);HOXA5蛋白阴性表达患者肿瘤低分化比例为41.38%,浸润深度T3~T4比例为77.01%,有淋巴结转移比例为48.28%,有远处转移比例为29.89%,明显高于HOXA5蛋白阳性表达的15.15%、27.27%、12.12%、6.06%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌组织中HOXA5阴性表达和TRIM14阳性表达患者的5年生存率分别为57.47%、59.09%,明显低于HOXA5阳性表达患者的90.91%和TRIM14阴性表达患者的87.50%,差异均有统计学意义(P<0.05)。死亡组患者有淋巴结转移比例为85.00%,有远处转移比例为55.00%,明显高于生存组的15.00%、7.50%,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Cox比例风险回归模型分析结果显示,TRIM14是结直肠癌患者5年内死亡的独立危险因素,HOXA5是结直肠癌患者5年内死亡的保护因素(P<0.05)。结论结直肠癌组织中TRIM14呈高表达状态,HOXA5呈低表达状态,两者均与TNM分期、肿瘤分化程度、浸润深度等临床病理特征及预后相关,有作为预后标志物及治疗靶点的潜力。

血清抗黑色素瘤分化相关基因5阳性皮肌炎胸部CT特征定性及定量分析

目的 定性及定量分析血清抗黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)抗体阳性的皮肌炎患者胸部CT特征及其与短期预后的关系。资料与方法 回顾性纳入2017年1月—2018年12月中日友好医院收治的67例MDA-5阳性的皮肌炎患者,分析胸部CT特征与短期不良预后的关系。结果 9例患者1年内死亡。死亡组与存活组间质性肺疾病(ILD)影像学类型(χ^(2)=9.964,P=0.025)和肺动脉直径/主动脉直径比值(U=103.0,P=0.004)差异有统计学意义。抗MDA-5抗体阳性的皮肌炎患者合并ILD影像学类型主要为机化性肺炎。弥漫性肺泡损伤的患者死亡率显著高于其他几种类型。Logistic回归分析显示,肺动脉直径/主动脉直径比值(OR 4.208,P=0.002)是抗MDA-5抗体阳性的皮肌炎合并ILD患者发生死亡的强独立危险因素。结论 MDA-5阳性皮肌炎患者大部分伴ILD,其中以机化性肺炎为主要特征。1年内不良预后患者ILD类型不同,但肺动脉直径/主动脉直径比值是MDA-5阳性皮肌炎合并ILD患者发生死亡的独立危险因素。

自杀率全球分布:集体主义和5-羟色胺转运体短等位基因协同进化的解释

为解释自杀率的全球分布,本研究基于世界卫生组织等权威机构公开数据,提出并检验了集体主义文化和5-羟色胺转运体短等位基因协同进化的解释模型。分析发现:集体主义文化和抑郁障碍患病率在5-羟色胺转运体短等位基因携带者人口占比与自杀率之间起链式中介作用。集体主义文化和5-羟色胺转运体短等位基因之间存在协同进化的假设获得初步支持,即集体主义文化可能缓冲了携带5-羟色胺转运体短等位基因给个体和群体带来的负面影响,降低了地区抑郁障碍患病率和自杀率。

人类白细胞抗原G基因5’上游调控区多态性与慢性丙型病毒性肝炎病毒载量的关系

目的探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)基因5’上游调控区(URR)多态性与慢性丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)病毒(HCV)载量的相关性。方法回顾性分析2015年4—12月在大连市公共卫生临床中心(原大连市第六人民医院)住院并确诊为慢性丙型肝炎的195例患者的临床资料。收集患者血样并提取基因组DNA和病毒核酸,采用聚合酶链式反应扩增HLA-G 5’-URR,然后使用基因测序技术检测患者HLA-G 5’-URR的16个多态性位点,采用定量PCR方法测定患者血清HCV病毒载量,分析HLA-G基因5’-URR基因多态性与HCV病毒载量的关系。结果195例慢性HCV感染者HLA-G基因5’-URR的16个多态性位点中,-762C>T、-725C>G>T、-716T>G、-689A>G、-666G>T、-633G>A、insG540、-509C>G、-486A>C、-443G>A、-400G>A、-398A>G、-201G>A和-56C>T 14个位点不同基因型患者的HCV病毒载量差异无统计学意义(P>0.05),而-477C>G、-369C>A 2个位点不同基因型患者的HCV病毒载量差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示,-477C>G位点CG基因型的HCV病毒载量高于GG基因型(P<0.05),-369C>A位点AC基因型的病毒载量高于AA基因型(P<0.05)。结论HLA-G基因5’-URR-477C>G位点CG基因型的HCV病毒载量高于GG基因型,-369C>A位点AC基因型的HCV病毒载量高于AA基因型,可能与HLA-G的表达水平改变有关。

CYP3A4、CYP3A5基因多态性与紫杉醇疗效及不良反应的相关性研究

目的探讨CYP3A4、CYP3A5基因多态性对紫杉醇疗效及不良反应的影响。方法选择我院2016年2月~2020年2月接受紫杉醇化疗的肿瘤患者67例作为研究对象,检测其CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因型,并将患者分为野生型组和突变型组。2周期后,对疗效和药物不良反应进行评估,分析患者的疗效及不良反应和CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因多态性的相关性。结果67例肿瘤患者中,CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因的野生型组、突变型组之间的疗效和不良反应指标均不存在显著性差异(P>0.05)。结论CYP3A4*1G、CYP3A5*3基因多态性与紫杉醇的疗效和不良反应不具有相关性。

过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OGD3h/R3h损伤细胞)、BIRC5干预组(细胞预先转染腺病毒-BIRC5质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MTT法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用RT-PCR和免疫印迹法分别检测各组细胞BIRC5和VEGF mRNA及蛋白表达。结果正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;BIRC5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达BIRC5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组和阴性对照组的BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组细胞BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达BIRC5基因对OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调VEGF表达有关,提示BIRC5调控VEGF表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。

抗黑素瘤分化相关基因5抗体阳性皮肌炎合并快速进展性间质性肺病的临床特征及危险因素

目的:通过分析抗黑素瘤分化相关基因5抗体(MDA5)阳性皮肌炎(DM)患者合并快速进展性间质性肺病(RPILD)和非RPILD的临床特点差异,探讨合并RPILD发生的危险因素。方法:回顾性分析南京医科大学炎性肌病及结缔组织病相关间质性肺病专病联盟组织收集的251例抗MDA5抗体阳性皮肌炎(MDA5+DM)患者临床资料,将其根据有无合并RPILD进行分组,采用t检验、U检验、χ^(2)检验及Logistic回归分析合并RPILD患者的临床特点,探讨RPILD发生的危险因素。结果:将251例患者分为RPILD组(89例)和非RPILD组(162例),2组患者性别、年龄、病程、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、抗Ro-52抗体阳性、铁蛋白(SF)、抗MDA5抗体滴度比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。单因素Logistic回归分析显示年龄、ESR、抗MDA5抗体滴度、性别(男性)、CRP、抗Ro-52抗体均有统计学意义(OR>1,P<0.05);多因素Logistic回归分析显示性别(男性)、CRP、抗Ro-52抗体有统计学意义(OR>1,P<0.05)。结论:年龄、ESR、抗MDA5抗体滴度可能增加MDA5+DM患者发生RPILD的风险,但不是独立危险因素;性别(男性)、CRP升高、抗Ro-52抗体阳性可能是MDA5+DM患者合并RPILD的独立危险因素,均与RPILD的发生呈正相关。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

人纤溶酶原Kringle 5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列 ,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle 5结构域的基因 ,并将其克隆至表达质粒 pET2 5b(+)中 .重组载体 pET2 5b(+) /kringle 5转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,在 12kD处可见明显的表达条带 ,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在 .包涵体经过体外变复性 ,SP SepharoseFF离子交换柱一步纯化 ,15%SDS PAGE鉴定考染一条带 ,纯度达 95%以上 .所得到的目标蛋白能明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生 .

人纤溶酶原Kringle5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5 (K5 )区基因 ,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定。方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因 ,构建K5的原核表达载体pET 2 2b(+) K5 6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+ -树脂亲和层析进行纯化 ,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性。结果经PCR成功扩增出了 2 4 3bp的K5区基因 ,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET 2 2b(+) ,重组质粒在BL2 1中成功表达出分子量为 14 0 0 0的蛋白质 ,纯化后的蛋白纯度达95 % ,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能 ,K5蛋白浓度为 4 μg/mL时抑制率达 5 0 %。 结论纤溶酶原K5的成功克隆。

马铃薯PYL5基因对非生物胁迫的响应分析及其启动子的活性鉴定

【目的】脱落酸(ABA)作为一种“应激激素”在植物生长发育和响应干旱、盐等非生物胁迫过程中发挥重要作用,PYR/PYL/RCARs(以下简称“PYL”)作为ABA受体在多种植物中也被广泛研究。基于对马铃薯StPYL5基因生物信息学及表达模式分析,并通过对其启动子活性鉴定,为进一步揭示马铃薯StPYL5功能及抗逆育种提供依据。【方法】根据转录组数据克隆得到StPYL5基因,通过DNAMAN、MEGA等软件分析了StPYL5的分子特征;通过qPCR检测了StPYL5基因的组织特异性及其对非生物胁迫的响应;利用PlantCARE网站对StPYL5基因启动子进行了分析,并通过瞬时转化烟草对其活性进行了鉴定。【结果】StPYL5基因全长534 bp,共编码177个氨基酸,蛋白质分子量20.19 ku,理论等电点(pI)为5.97。系统进化分析显示,StPYL5与SpPYL9-like亲缘关系较近。组织特异性分析结果显示,青薯9号(QS9)中StPYL5在根和叶中表达量较高,其次分别是茎和花,在块茎中表达量较低。不同胁迫下StPYL5表达量分析表明,青薯9号(QS9)中StPYL5在干旱、低温、盐和ABA胁迫下的表达量先升高后降低,且StPYL5的表达受Me JA和SA的诱导。此外,笔者成功克隆得到2 000 bp的StPYL5基因启动子。在烟草中的瞬时转化后的组织化学染色结果表明,StPYL5基因启动子具有成功启动下游GUS报告基因表达的启动子活性。【结论】全面分析了StPYL5基因的分子特征及其在多种非生物胁迫下的表达谱,并成功克隆到具有活性的pStPYL5启动子,该结果为深入研究StPYL5基因的功能以及马铃薯抗逆育种提供依据。