杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶.以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带.两型漆酶分别命名为LacA和LacB.经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5～5.5之间.LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5μmol·L-1和292.4nmol·mL-1·min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0μmol·L-1和127.4nmol·mL-1·min-1.

灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化，得到电泳纯漆酶．SDS-PAGE电泳结果显示，该漆酶表观分子量为62×10^3．Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成，为单体酶．试验结果表明，该漆酶的最适反应温度为60℃，与ABTS的最适反应pH为4．5，Km为0．188mmol／L，在pH6．0～8．0之间较稳定．Fe^2＋、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用，EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用．

灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质

灵芝超高压突变株G1502的发酵液经浓缩、DEAE-纤维素柱层析，纯化出一种漆酶。其最适作用温度为45℃，在不高于45℃的条件下保存5h，残余酶活在97％以上；最适pH为4．4，在pH=3．8～6．6内保存，残余酶活在80％以上。漆酶催化愈创木酚的vmax和Km分别为2．28μmol·L^-1·min^-1和1．94×10^-4mol·L^-1。金属离子K^＋和Cu^2＋对酶有激活作用，Fe^2＋、Co^2＋、Ca^2＋、Na^＋、Ba^2＋对酶活有很大的抑制作用。

灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

将灵芝(Ganoderma lucidum)漆酶经过Sephadex G-75和DEAE-Sepharose Fast Flow两步纯化,获得具有3个同工酶的组分,并且纯度提高了81倍,酶活回收率高达83.9%。以ABTS为底物,漆酶最适pH值是2.2～2.6,在pH值4.6～7.8范围内稳定;最适温度45℃,在低于45℃时较稳定。大部分金属离子、酸根离子对灵芝漆酶普遍有抑制作用,除盐可以提高漆酶活力。

香菇漆酶的纯化及部分性质研究

对香菇漆酶进行了丙酮分级沉降、半透膜透析、DEAE-纤维素及Sephadex G100柱层析纯化，并研究了漆酶的产酶曲线及酶作用最适条件。结果表明：在该培养条件下，香菇第10天达产酶高峰，峰值酶活为216U/mL，酶作用的最适pH值为3.6，在pH值3.6-4.6有较强的稳定性。最适酶解温度为30℃，Ba2＋、Cu2＋对香菇漆酶有激活作用，而Ag＋、Fe3＋则能明显抑制漆酶活性，其它离子影响相对较小。以邻联甲苯胺为底物的表观Km值为1.68mmol/L。

白腐菌TP21漆酶分离纯化及其部分酶学特性的研究

白腐菌TP21漆酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析,得到了电泳纯的漆酶,总酶活回收率达到25.7%,纯化了37.1倍,酶的相对分子质量为61.5×103,其最适作用温度为45℃.漆酶催化愈创木酚的υm和Km分别为4.5×10-3mmol.L-1.min-1和2.22×10-5mmol/L.金属离子K+和Mn2+对酶有激活作用,Fe2+、Fe3+、Ca2+和Co2+对酶活有很大的抑制作用.

家蚕表皮酪氨酸酶和漆酶的分离纯化及酶学鉴定

酚氧化酶是昆虫黑化反应的关键酶类。采用硫酸铵分级(20%～30%、40%～65%饱和度)沉淀以及ConA Sepharose4B亲和层析和Sephacryl S-200凝胶过滤的方法,从家蚕蛹表皮样品中分离纯化出酪氨酸酶和漆酶,2种酶的比活力分别达到2 900、1 343 U/mg。经非还原SDS-PAGE电泳和酶学动力学特性分析表明:家蚕表皮酪氨酸酶的分子质量约80 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物酪氨酸和邻苯二酚染色呈现棕褐色条带,该酶与2种底物的米氏常数(Km)分别是16.8 mmol/L和12.5 mmol/L,最适pH分别是6.5和7.5,最适温度均是30℃;家蚕表皮漆酶的分子质量约44 kD,酶蛋白经凝胶电泳分离后用底物2,2'-氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)染色呈现蓝绿色,而用酪氨酸染色颜色没有变化,该酶与底物ABTS的Km值是32.7 mmol/L,最适pH 5.0,最适温度50℃;酪氨酸酶的热稳定性比漆酶高。研究结果表明,采用硫酸分级沉淀、亲和层析和凝胶过滤方法能从家蚕表皮中分离纯化出漆酶和酪氨酸酶,酶学动力学分析二者对催化底物的特异性有差别,推测它们在家蚕表皮的硬化和黑化过程中发挥不同生理作用。

灵芝突变株G1502漆酶的分离纯化及酶学性质研究

对灵芝突变株G1502发酵液中漆酶的分离纯化方法及酶学性质进行了初步研究。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析发现,G1502在发酵时只分泌一种漆酶。发酵液经透析浓缩、DEAE-纤维素柱层析,比活力提高24.28倍,酶活力回收率18.66%。以愈创木酚为底物时该酶的动力学常数Km=1.94×10-4mol/L,Vmax=2.28×10-6mol/L·min;愈创木酚浓度高时对酶活性有抑制作用。K+对酶有激活作用,Cu2+激活作用不大,Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、Ba2+对酶活力有抑制作用。

香菇漆酶同工酶的部分酶学性质的研究

通过丙酮分级沉淀、DEAE-纤维紊离子柱层析和Sephadex G100柱层析得到两种香菇漆酶同工酶，分别命名为lac1和lac2，并对其理化性质进行了研究。考察了香菇漆酶同工酶最适反应温度和pH值、热稳定性和pH值稳定性、反应动力学常数以及金属离子对酶活的影响。试验结果表明：Lac1、lac2最适作用温度都为30℃，在不高于40℃的条件下保存30min，lac1残余酶活在60％以上，lac2在不高于60℃有较高热稳定性，残余酶活在80％以上。最适pH值，lac1为3．6，lac2为4．0。pH值3.0-4.8，lac1有较强稳定性，在pH值4.0-4.6，lac2有较强的稳定性。以邻联甲苯胺为底物lac1和lac2的Km分别为0．964mmol／L和1.38mmol／L。金属离子Cr对lac1有激活作用，Ag^＋、Mn^2＋对lac1有抑制作用。金属离子Ba^2＋和Cu^2＋对lac2有激活作用，Fe^3＋、Cl^-、Ca^2＋、Zn^2＋、Ag^＋、Mn^2＋对lac2有抑制作用。

灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质

采用冻干浓缩、(NH4)2SO4盐析、Hi Trap phenyl(FF)疏水层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析对灵芝EIM-40发酵液进行分离纯化,获得纯化漆酶,纯化倍数为14.6,回收率为5.3%。SDS-PAGE银染的结果为单一条带,相对分子质量约为6.53×104。以愈创木酚和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为催化底物进行酶学性质研究,最适pH分别为4.8和4.5,最适温度分别为55和50℃,2种底物在pH 4.0～5.0范围内,温度低于50℃时,酶的稳定性都很好。以愈创木酚为底物,Km=645.0μmol/L;以ABTS为底物,Km=22.2μmol/L。Cu2+对该酶起激活作用,Fe2+、Ca2+、Ba2+则完全抑制酶的活性。