产漆酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件的初步优化

从甘蔗渣滤泥中筛得一株具有漆酶活性的细菌SYBC star X,通过16S r RNA基因序列分析,并结合生理生化实验及形态学观察,鉴定为考克氏菌属(Kocuria);利用液态发酵法研究了碳源、氮源、金属离子对其发酵产漆酶的影响,确定菌株SYBC star X的最优碳源为15 g/Lα-乳糖,最佳氮源为40 g/L大豆蛋白胨,最适铜离子和锰离子的浓度分别为3 mmol/L和0.4 mmol/L。

一株耐辐射考克氏菌的分离与鉴定

从10kGy60Coγ射线辐照处理的新疆戈壁土壤中分离到一株耐辐射微生物I-7R,该菌菌落为橙红色革兰氏阳性球菌。最适生长温度为30℃,(G+C)mol%含量为67.5%,不具有氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、利福平及壮观霉素等抗性。UV辐射生存曲线显示,I-7R菌株与大肠杆菌K-12相比,具有较强的紫外辐射抗性。16S rDNA序列比较分析表明I-7R菌株与Kocuria rosea、K.erythromyxa以及K.polaris同源性达到99%。结合I-7R菌株生理生化试验结果,该株菌归属于考克氏菌属(Kocuria),并与Kocuria rosea最为相近,暂命名为K.rosea I-7R。

一株木质素降解菌的筛选、鉴定及其漆酶发酵条件的优化

采用愈创木酚-PDA平板显色、Azure-B蓝色平板脱色初筛,摇瓶发酵复筛,从腐木中筛选到木质素酶高活性菌株Lys3002.经ITS测序分析和形态观察,Lys3002鉴定为毛栓菌(Trameteshirsuta).采用液体摇瓶优化发酵条件,结果表明:野生型菌株Lys3002的木质素酶系中漆酶的最适发酵条件是:麸皮20g/L,豆饼粉6g/L,培养基初始pH6.0,MgSO4·7H2O0.5g/L,CuSO4·5H2O0.05g/L,MnSO40.05g/L,培养温度30℃,发酵周期5d,漆酶活力高达597.82U/L,具有深入研究价值和应用潜力.

东祁连山高寒草地土壤产漆酶真菌的筛选、鉴定及产酶条件的初步研究

以高寒草地土壤分离出的５６个真菌菌株为研究对象，经愈创木酚-ＰＤＡ培养基和α- 萘酚-ＰＤＡ 选择性培养基初步筛选，再根据菌株在愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基上菌体生长及菌落大小、漆酶催化氧化还原反应产生的变色圈直径大小及其变色圈颜色深浅程度，以及测定油菜秸秆诱导的液体发酵产漆酶活力，筛选出１株产漆酶酶活真菌菌株（编号为３１０ｂ）。经ｒＤＮＡ-ＩＴＳ基因序列分析，初步鉴定为Marasmius tricolor 。对菌株３１０ｂ产漆酶的条件进行了初步研究，结果表明，菌株３１０ｂ在２５℃ 培养条件下产漆酶活力最大，初始ｐＨ 值为４．０时，漆酶活力最大，蔗糖、蛋白胨分别为诱导菌株产漆酶活力最高的碳、氮源。几种非营养有机物对菌株产漆酶活力大小不同，α- 萘酚和吐温-８０对菌株产漆酶没有明显影响，愈创木酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌株产漆酶，其中吲哚乙酸抑制作用最强烈（P＜０．０１）。在Ｃｕ２＋ 浓度为０．００１～０．０２５ｇ／Ｌ 范围内，随Ｃｕ２＋ 增加，产漆酶活力增加，０．０２５ｇ／Ｌ 时产酶活力最大。随着接种量的增加，诱导漆酶活力增加。在６０～１８０ｒ／ｍｉｎ的转速范围内，随着转速的增加，漆酶活力增加。油菜秸秆粉的量在０～１ｇ范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力增加；１～２ｇ范围内，随着秸秆添加量的增加，漆酶活力减小。

一株产漆酶菌株的分离及对造纸废水的处理研究

[目的]筛选出活性较高的产漆酶细菌菌株。[方法]利用含0.2 mmol/L Cu2+的LB富集培养基,从造纸厂污泥中分离得到一株编号为WG35的细菌,并结合形态学观察、生理生化特性研究以及16S r DNA序列分析对其进行鉴定。[结果]经鉴定,WG35菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。用菌株WG35所产漆酶处理造纸黑液,处理3 d后造纸黑液BOD/COD比值可达0.85,可生化性较好。[结论]该研究为细菌漆酶生产提供了理论依据。

高寒草地土壤产漆酶真菌的筛选及分子鉴定

以高寒草地土壤分离出的9株真菌菌株为研究对象,采用rDNA-ITS方法对筛选出的产漆酶菌株进行分子鉴定,根据菌株在愈创木酚、蒽酮、邻苯二酚、邻联甲苯胺、邻甲苯胺、α-萘酚、联苯胺、没食子酸为底物的选择性培养基上的生长情况、菌落大小、漆酶催化氧化还原反应产生的变色圈直径大小及其颜色深浅程度,进行产漆酶真菌初筛,采用液体产酶发酵法选用ABTS为底物测定漆酶活力进行复筛。鉴定结果为菌株1.9为Uncultured fungus clone.,2.1a为Scytalidium,310b为Marasmius tricolor,2.1c为Saccharicola,2.3a为fungal sp,2.4d为Saccharicola.,10a为Marasmiusrotalis,3.7c为Alternaria.WB为Verticilliumlongisporum。筛选结果表明:除菌株3.7c以外,其余8株菌株在以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺为底物的培养基上基本都产生氧化带,在没食子酸底物培养基上均不产生氧化带;菌株1.9,2.1a,310b,2.4d,10a,2.1c,2.3a均具有产漆酶活力,其中菌株310b具有较强产漆酶活力。

灰葡萄孢菌胞外大分子分泌物的植物毒性及漆酶性质鉴定

采用透析的方法提取灰葡萄孢菌分泌的大于14 kD的胞外大分子物质,将其接种到番茄和菊花叶片组织,检测灰葡萄孢菌胞外大分子分泌物的植物毒性,并以鞣酸和RB亮蓝为指示剂鉴定灰葡萄孢菌胞外大分子分泌物的漆酶性质。结果显示:灰葡萄孢菌胞外大分子分泌物可导致叶片组织坏死,具有植物毒性;接种灰葡萄孢菌后第3天,鞣酸和RB亮蓝平板出现不同程度的显色反应,第6天时平板几乎完全显色,胞外大分子物质具有漆酶性质。

高产漆酶菌株的筛选、鉴定和固态发酵条件优化

本试验旨在筛选高产漆酶菌株,并对其固态发酵条件进行优化。利用平板显色和酶活性测定的方法,从33株木腐菌(白腐菌和褐腐菌)中筛选出1株高产漆酶菌株,采用单因素试验和正交试验设计对其产漆酶固态发酵条件进行优化。结果表明:33株木腐菌中25号菌生长最快,发酵底物中漆酶活性最高。经分子生物学鉴定,确定该菌株为灵芝属。经对培养基含水量、接种量、通氧量和发酵时间等发酵条件进行单因素试验和正交试验,最终获得其最优固态发酵条件为10 g麸皮、62.5%水分、5%接种量、通氧量15%、培养温度30℃、培养时间120 h。该菌株经发酵条件优化后,漆酶活性达9522.22 U/g,较优化前(3111.53 U/g)提高了2.06倍。

甘蔗糖厂成糖工序生产线样品中部分细菌菌株的鉴定

通过16S r RNA序列分析,结合微生物的形态学观察、生理生化试验对甘蔗糖厂成糖工序生产线检出的部分细菌进行了分离鉴定。结果显示,从甘蔗糖生产线样品中获得常见的4株菌,菌株S-1鉴定为克氏库克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、菌株S-3为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。因此,糖厂应该加强微生物污染源和污染途径的监控,以此保证甘蔗糖品质。

86株库克菌的鉴定与抗菌药物敏感性试验

目的对医疗环境中分离的库克菌进行鉴定与抗菌药物敏感性试验,为临床经验治疗库克菌感染提供循证医学证据。方法收集在医院感染卫生学监测中,采集医务人员手、皮肤黏膜、空气、物体表面等样本中离的86株库克菌,应用ATB Expression半自动细菌鉴定药敏分析仪配套ID32Staph鉴定试条和Staph 5药敏试条,进行菌株鉴定和药敏试验。结果 86株库克菌鉴定检出玫瑰库克菌62株、变异库克菌16株、克库克菌8株。库克菌对诺氟沙星(16.3%)和呋喃妥因(20.9%)敏感率较低,对红霉素(69.3%)和庆大霉素(67.4%)敏感率接近70.0%,对青霉素等其他12种抗菌药物敏感度在80.0%以上,甚至为100.0%。结论库克菌对大多数敏感,临床医生和微生物检验人员应加强库克菌临床感染认识和诊治水平,合理使用抗菌药物。

一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究

采用愈创木酚显色法筛得一株产漆酶周期较短的丝状真菌.通过形态学观察和分子生物学序列分析,鉴定其为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）,并对所获菌株进行了发酵条件优化.通过单因素试验和正交试验获得该菌的最佳发酵条件为：蔗糖25g/L、麸皮汁80g/L、酒石酸铵10g/L和豆粕18g/L,KH2PO4 2,MgSO4·7H2O 0.6,CaCl2·2H2O 0.8,Cu2＋0.25（1mM）,pH 5.5~6.5,其漆酶最高酶活水平为571.32U/L.

高温漆酶产生菌Bacillus thuringiensis strain Lac-72的筛选、鉴定及其酶学性质研究

从云南省大理州洱源县牛街镇72℃地热温泉底泥中筛选到1株产漆酶的高温菌。对其进行显微形态及生理生化特征、16 S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的一株菌,命名为Bacillus thuringiensis strain Lac-72。对其酶学性质及漆酶对染料废水的处理进行了研究。结果表明:Lac-72漆酶最适酶活温度为75℃,最适反应pH值为8.0。在25℃以下,能保持良好的稳定性。Zn^2+、Mn^2+和K^+对该酶有一定的抑制作用,Ca^2+、Mg^2+、Fe^2+、Cu^2+均对该酶活力起到促进作用,其中Cu^2+的促进效果最为明显。在最适酶活条件下,对三苯甲烷类染料孔雀石绿和结晶紫废水进行脱色,脱色率分别可达85%和72%。

4种栽培基质诱导对毛木耳781液体发酵产漆酶活力的影响

以毛木耳781菌株为研究对象,进行DNA测序鉴定确定其种源可靠性,再研究添加木屑、麦麸、棉籽壳和玉米芯4种材料对其液体发酵产漆酶活力的影响。结果表明:供试菌株测序结果同毛木耳相似性高达98%以上,为毛木耳下的一个分支。不同诱导培养基对漆酶活性的影响差异极显著(P<0.001),但它们的漆酶活力各不相同。相比之下,含麦麸的基本培养基中漆酶活力高于含木屑、玉米芯或棉籽壳的基本培养基,说明麦麸更适合作为提高毛木耳781菌株产漆酶能力的诱导物。

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶（DlLAC）家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示：DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.

一种野生香蘑的分离、鉴定、培养条件与产酶特性

为充分开发利用野生食用菌资源,从采集自北京怀柔的野生香蘑子实体中分离获得纯培养,编号为Lepista sp.GSM-11,结合形态学特征与ITS序列分析鉴定其分类学地位,并进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、生长因子、最适温度和最适pH值,并测定了菌体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶、核糖核酸酶和凝集素的特性,同时还研究了Cu2+对漆酶产量的影响.结果表明,该菌株与GenBank中报道的采集自中国辽宁、美国马里兰州和日本宫城的紫丁香蘑(Lepista nuda)同源性最高,分别为100%、99.98%和99.93%,确定该野生香蘑为紫丁香蘑(ITS序列GenBank登录号JQ519375);菌丝体生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母浸膏,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素C,最适温度为24℃,最适pH为7.0;GSM-11菌株菌丝体和发酵液中均具有漆酶活性,但缺乏其他3种酶和凝集素活性.1.0～2.0 mmol/L的Cu2+对漆酶分泌有显著的促进作用,其活性达到对照组的149.2%～196.4%.

一株产漆酶细菌的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得产漆酶的细菌菌株,研究漆酶的酶学性质并应用于染料脱色。【方法】利用含铜的富集培养基筛选产漆酶细菌;通过形态特征、生理生化试验及16SrDNA序列分析等方法进行鉴定;以丁香醛连氮为底物测定漆酶的酶学性质;通过测定染料在最大吸收波长下吸光值的变化评价漆酶对染料的脱色效果。【结果】从森林土壤中筛选到一株漆酶高产菌株LS05,初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);菌株LS05的芽孢漆酶以丁香醛连氮为底物的最适pH为6.6,最适温度为70°C;该酶具有较好的稳定性,经70°C处理10 h或在pH 9.0条件下放置10 d后可保留活性。对抑制剂SDS和EDTA具有一定的抗性,在碱性条件下可有效脱色不同的工业染料,RB亮蓝、活性黑和靛红1 h内的脱色率达93%以上。【结论】Bacillus amyloliquefaciens LS05的芽孢漆酶在高温和碱性条件下稳定性强,相对于真菌漆酶具有更好的工业应用特性,可有效用于工业染料废水的处理。

香蕉漆酶基因家族鉴定及低温胁迫下的表达分析

为研究香蕉漆酶基因家族成员的功能,采用生物信息学方法鉴定香蕉漆酶基因成员,分析其低温胁迫下的表达情况,为香蕉抗寒研究提供理论依据。从香蕉A(Musa acuminata)基因组筛选了22条漆酶基因(MaLAC),从香蕉B(Musa balbisiana)基因组筛选了11条漆酶基因(MbLAC),通过生物信息分析发现MaLAC比MbLAC更保守。分子进化树分析结果表明MaLAC可分为5类,MbLAC可分为4类。启动子顺式作用元件分析结果表明,MaLAC启动子序列包含大量光响应、激素应答及非生物胁迫等应激响应元件,推测MaLAC基因家族在响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用。利用qRT-PCR技术对MaLAC部分成员在响应不同低温胁迫的表达情况进行分析,MaLAC3-2、MaLAC4、MaLAC4-5、MaLAC17在低温(13、4、0℃)处理下表达量均极显著高于对照(28℃),推测可能在香蕉响应低温胁迫的过程中发挥重要作用。预测香蕉MaLAC家族有18个成员受miRNA调控,主要受miR397和miR408的调控;推测香蕉MaLAC可能参与miRNA调控途径。

一种白腐真菌的分离、鉴定、培养及产漆酶条件

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌，往往具有高产胞外漆酶的活性. 从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株，编号为BUA-01. 结合形态学特征与ITS序列分析，确定其分类学地位；进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比（C/N）、生长因子、最适温度和最适pH值；利用不同浓度Cu^2＋（CuSO4）的诱导，探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响；通过向发酵液中加入3种偶氮染料（依文思蓝、甲基橙和铬黑T），研究菌株对染料的降解效果. 结果表明，该菌株与毛栓菌（Trametes hirsuta）的同源性最高，为100%，遗传距离为0，确定BUA-01菌株为栓菌属（Trametes）真菌. 菌丝体生长的最适碳源为淀粉，最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉，最适C/N值为40/1和10/1，最适温度为37 ℃，最适pH为6.0-7.0，供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用. 0.25 mmol/L的Cu^2＋对胞外漆酶产量有极显著的促进作用，在96 h时，发酵液的活性达到最高，为1081.33 ± 6.3 U/mL，是对照组的26倍. BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著，12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31% ± 0.16%、92.37% ± 0.42%和79.25% ± 0.64%. 本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值. （图3 表7 参42）

高产漆酶革耳的分离鉴定、培养条件、液体发酵及偶氮染料脱色

漆酶能够高效降解木质素、酚类、胺类等难降解化合物,在造纸、纺织、环保等诸多领域具有良好应用前景.以采集自广西十万大山国家森林公园的高产漆酶革耳属真菌为材料,开展分类鉴定、菌丝最适培养条件、液体发酵产漆酶条件以及染料脱色活性研究.结合形态鉴定与ITS鉴定,确定目标菌株F1625为野生革耳(Panus rudis);结合生长速度和长势,菌丝生长最适碳源为葡萄糖,氮源为酵母浸粉,碳氮比为10/1-20/1,生长因子为维生素B_(1)或维生素C,pH为6-8,温度为32℃,该菌株为高温菌株.液体发酵产漆酶研究表明,PD培养基优于菌丝最适培养条件培养基,Cu^(2+)对产漆酶有抑制作用,而愈创木酚能够诱导漆酶表达.PD培养基添加3.20 mmol/L愈创木酚,在144 h时达到最大酶活,为(4.59±0.04)×10^(3)U/L.F1625菌株发酵液对偶氮染料脱色效果显著,24 h对伊文思蓝和铬黑T的脱色率分别为60.83%±1.40%和65.03%±0.67%.本研究表明F1625菌株在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值.(图7参26)

野生槐耳的分离、鉴定、培养条件及产漆酶能力

以采集自北京香山公园加拿大杨（Populus canadensis）的槐耳子实体为材料,利用组织分离获得纯培养并保存,编号为XS-01.结合形态与ITS鉴定确定其分类地位,进一步开展菌丝最适生长条件和液体发酵产漆酶研究.通过PCR扩增,获得长度为598 bp的部分ITS序列（KY933481）,采用MEGA 6.0构建发育树、测定遗传距离,XS-01与槐生多年卧孔菌（Perenniporia robiniophila）相似性最高,为100%,遗传距离为0.000.进一步结合子实体和菌丝形态,确定XS-01为槐生多年卧孔菌.结合生长速度和长势,确定了该菌株的最适生长碳源为淀粉和麦芽糖,最适生长氮源为酵母浸粉,最适生长C/N比为30/1-60/1,最适生长温度为32℃,最适生长pH 7,最适生长因子为VB1.Cu^（2＋）诱导的胞外漆酶发酵研究表明,1.0 mmol/L Cu^（2＋）对漆酶产量有显著的促进作用,产量在96 h达到最大值,为417.5 U/mL,比对照组提高93.4%,而2.0 mmol/L Cu^（2＋）对漆酶产量有显著抑制作用,96 h酶活为79.0 U/mL,是对照组的36.6%.本研究获得具有高产胞外漆酶能力的槐耳菌株,具有潜在的应用开发价值.