基因表达谱芯片发现36条喉鳞癌相关基因

目的 :研究探讨喉鳞癌发生、发展中相关基因群的表达和初步功能。 方法 :按微矩阵排列的 40 96种全长基因 PCR产物制成 Bio Door40 96型微矩阵表达谱芯片 ;采用条件优化的一步法抽提喉鳞癌及正常组织总 RNA,用 Qiagen公司 Oligotexm RNA离心柱分离纯化两种组织的 m RNA;经逆转录合成荧光分子 (Cy3/ Cy5 )掺入的 c DNA一链制备表达谱探针 ,芯片杂交和严格洗片后 ,用 Scan Array30 0 0荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像 ,利用计算机分析肿瘤及正常组织中差异表达的基因。对所获得的基因进行分子生物信息学分析。结果 :在 40 96种基因中 ,喉鳞状细胞癌与正常组织间存在差异表达的基因。在所检测的 4对临床标本中 ,发现有差异表达的基因 36条 (0 .88% )。生物信息学分析显示 ,该 36条差异表达基因与肿瘤的发病机制可能存在相关性。结论 :喉鳞状细胞癌的发生、发展中存在多基因表达调控的改变 。

凋亡相关基因在喉鳞癌中的表达概况

目的了解凋亡相关基因在喉鳞状细胞癌中的表达概况,探寻其在喉鳞癌及正常喉组织中的表达差异及意义。方法提取喉鳞癌及癌旁正常喉组织的总RNA,采用Ampolablaleing-LRP方法,分别将上述提取的RNA合成生物素标记的cDNA探针。将合成的探针与细胞凋亡GEArrayQ芯片膜(96个凋亡相关基因)进行杂交。采用化学发光方法.并用X感光片记录喉鳞癌标本和对照标本的基因信号表达强弱。将X光片感光点转化成TIFF图形文件,使用ScanAlyze和GEArrayAnalyzer软件进行资料分析。结果利用基因芯片杂交筛选的方法,在所分析的与凋亡相关的96个基因中,survivin、bcl-2、TNF-β/Lta、TNF-α等23个基因在喉鳞癌组织中表达上调;bak、bax、bik、p53等22个基因表达下调。结论通过细胞凋亡GEArrayQ芯片膜杂交筛查的方法发现,在喉鳞癌中抑制凋亡的基因表达上调,促进凋亡的基因表达下调,这些基因改变组成了喉鳞癌特异的与凋亡相关的基因表达谱,为全面系统地研究喉鳞癌中与凋亡相关基因表达情况,及探讨喉鳞癌的发病机制提供了有益的线索。

喉癌基因的差异表达

目的 从分子水平上探讨喉癌的发病机制。方法 用微阵列 (Microarray)技术分析了114 31个基因在喉癌组织和其临近的正常黏膜组织表达差异 ,用RT PCR技术分析所得喉癌差异表达基因中一个基因在不同类型喉癌中的表达情况。结果 喉癌组织和其临近的正常黏膜组织基因表达相差 3倍以上者为 35个 ,其中上调基因 8个 ,下调基因 2 7个 ;相差 5倍以上者 7个 ,皆为下调基因 ;上皮膜蛋白基因 1(Theepithelialmembrane 1,EMP 1)是下调基因中一个基因 ,EMP 1在不同类型配对喉癌中皆呈低表达 ,明显低于相应的正常喉黏膜组织 (P <0 0 5 )。结论 喉癌的发生涉及多个基因参与 ,微阵列技术分析喉癌差异表达基因是可靠的方法。

N-myc下游调控基因2蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及对人喉表皮样癌细胞生物学特性的影响

目的检测N-myc下游调控基因2(N-myc downstream regulated gene 2,NDRG2)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其人类上皮细胞2型((Human Epithelial cells of type 2)对人喉表皮样癌细胞(Hep-2细胞)侵袭的影响。方法收集西安交通大学第一附属医院2014年1月1日至2017年12月31日接受喉部分切除术的病人,共计41例喉鳞状细胞癌组织及癌旁组织。采用免疫组织化学检测喉鳞状细胞癌组织中NDRG2的表达,χ^2检验分析不同临床病理特征分组中NDRG2阳性率的差异;实时定量聚合酶链式反应及蛋白质印迹法检测喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中NDRG2的表达水平;Transwell检测NDRG2对Hep-2细胞侵袭及转移的影响。结果41例喉鳞状细胞癌组织中NDRG2的阳性率明显低于癌旁组织,(χ^2=30.781,P<0.05)TNM III期和IV期及淋巴结转移的喉鳞状细胞癌病人中NDRG2的阳性率低于TNM I期和II期及未发生转移的病人(TNM I和TNM II NDRG2阳性率:37.500%,TNM III和IV NDRG2阳性率:5.882%,χ^2=5.394,P<0.05;无淋巴结转移病人NDRG2阳性率:55.556%,有淋巴结转移病人NDRG2阳性率:15.625,χ^2=6.073,P<0.05)。此外,Hep-2细胞中NDRG2的表达也明显低于正常鼻咽上皮NP-69细胞[Hep-2(1.193±0.053),NP-69(0.238±0.072),t=3.536,P<0.05]。上调Hep-2细胞中NDRG2的表达后,转移[Lv-control(141.328±23.424)个,Lv-NDRG2(54.925±16.825)个,t=4.413,P<0.05]及侵袭[Lv-control(71.782±18.675)个,LvNDRG2(25.931±9.729)个,t=3.757,P<0.05]细胞数目显著降低。结论NDRG2在喉鳞状细胞癌组织及细胞中低表达,并可作为抑癌基因抑制Hep-2细胞增殖、侵袭及转移。

转染LCRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析

背景与目的:LCRG1基因是我室利用mRNA差异显示技术克隆的一个喉癌相关抑癌基因。先前的研究显示将LCRG1转染喉癌细胞系Hep-2,发现其具有抑制细胞增殖、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤能力的作用。本研究旨在利用比较蛋白质组学的方法筛选LCRG1抑瘤作用相关的蛋白质。方法:抽提稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)的细胞总蛋白,采用双向凝胶电泳技术分别分离其总蛋白。考马斯亮蓝染色显色,PDQuest图像分析系统分析获取的2-D胶图像,从胶中选取差异表达的蛋白质点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析,最后Mascot软件搜索数据库初步鉴定蛋白质。结果:获得了重复性和分辨率较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,总蛋白质点数分别为1075±43和1027±23,平均匹配率为91%。图像分析差异蛋白质点,质谱鉴定了20个差异表达的蛋白质点,其中MALDI-TOF-MS鉴定了16个,ESI-Q-TOFMS/MS鉴定了4个。对这些初步鉴定的差异蛋白质进行功能分析,发现一些与细胞代谢、转录调控相关的蛋白质。结论:建立了稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,应用质谱技术识别并鉴定出一些与LCRG1抑瘤作用相关的差异表达蛋白质,为进一步研究LCRG1作用的分子机制提供新的线索。

P73基因在喉鳞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨P73基因在喉鳞癌中的表达。方法 用原位杂交方法检测 4 9例喉鳞癌组织、19例声带息肉、12例癌旁组织及 8例非典型增生组织中P73的表达。结果 喉鳞癌组织P73阳性表达 2 6例定位于胞浆 ,9例定位于腺体 ,5例定位于胞核 ,9例未表达。P73阳性表达率在喉鳞癌组织、声带息肉、癌旁组织及非典型增生组织中分别为 5 3.0 6 % (2 6 / 4 9) ,36 .84 % (7/ 19) ,4 1.6 7% (5 / 12 ) ,37.5 % (3/ 8) ,P73与喉鳞癌的临床分型、分期无相关性。结论 P73基因可能并非喉癌癌变过程中的靶基因 ,在喉癌的发生发展中可能不发挥重要作用。

喉鳞状细胞癌中C-erbB-2和E-钙粘附素蛋白表达及其意义

目的:探讨癌基因c-erbB-2蛋白和黏附分子E-钙黏蛋白(E-cad)表达与喉鳞状细胞癌(LSCC)的发生、发展和生物学意义。方法:应用免疫组织化学方法,检测45例LSCC组织和15例声带息肉(VCP)组织中c-erbB-2和E-cad蛋白表达水平。结果:在LSCC组织中c-erbB-2和E-cad表达阳性率分别为75.6%(34/45)和62.2%(28/45)。LSCC中,c-erbB-2表达阳性率高于VCP(0/15,0.0%,χ2=22.12,P<0.01),而E-cad表达阳性率低于VCP(15/15,100%,χ2=4.73,P<0.05)。c-erbB-2高表达和E-cad低表达与LSCC分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。LSCC中c-erbB-2表达与E-cad表达呈负相关(r=-0.30)。结论:c-erbB-2和E-cad表达水平可作为判断LSCC分级和淋巴结转移和预后的重要参考指标。

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义。方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性。结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6,限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L。结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。

肿瘤坏死因子受体2在喉鳞癌裸鼠模型中的表达及意义

目的:利用脂质体转染肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)于喉鳞癌裸鼠模型中,探讨转染的最佳剂量及时间。方法:构建喉鳞癌裸鼠模型,将不同剂量TNFR2于不同时间转染至模型中,利用流式细胞术及免疫组织化学法测定TNFR2的表达。结果:鳞状细胞癌荷瘤裸鼠的瘤组织基本不表达TNFR2。转染TNFR2后,48 h蛋白表达达高峰,主要为细胞膜表达。给瘤体内转染5μg TNFR2效果最佳,蛋白表达水平最高。结论:TNFR2的最佳转染剂量为5μg,48 h可达高峰。此结果为喉鳞癌的基因治疗提供了依据。

喉部鳞状细胞癌组织中p_(53)蛋白的免疫转印分析

为观察喉部鳞状细胞癌及其癌旁组织中P53蛋白的降解及其寡聚物的形成，采用免疫转印法分析了15例喉部鳞状细胞癌标本中P53蛋白的电泳行为。发现P53蛋白阳性率在癌灶中心组织中为100％，在癌旁组织中为66．7％，两组间相差显著（P＜0．05）。在所有标本均未发现P53蛋白寡聚物，且P53蛋白均有不同程度的降解，其中发生完全降解者（分子量均低于53kD）在癌灶中心组织中为60．0％，在癌旁组织中为30．0％（占阳性例数的比例），且癌旁组织中P53蛋白的平均分子量较癌灶中心组织低，但是，无统计学意义（P＞0．05）。

单层上皮细胞角蛋白在声门上型喉癌中的表达

目的 探讨角蛋白(cytokeratin,CK)19,CK18在声门上型喉癌中的表达及其临床意义。方法 用免疫组化法观察60例声门上型喉癌术后标本CK19,CK18的表达。结果①60例声门上型喉癌组CK19表达阳性53例,阳性率88.3％,而CK18呈阴性表达;②60例声门上型喉癌CK19表达与病理分级有关:中分化组与低分化组(P=0.019),高分化组与低分化组(P=0.003)之间的差异显著,而与TNM分期无关(P=0.186);③60例声门上型喉癌CK19表达在有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组(P=0.019);④60例声门上型喉癌CK19表达与生存时间无关(P=0.438)。结论60例声门上型喉癌CK19表达与病理分级及淋巴结转移有关,而与TNM分期及生存时间无关。

喉鳞癌组织与相邻正常黏膜的基因表达谱差异

目的:研究喉鳞癌组织与相邻正常黏膜的基因表达谱差异。方法:对2例经病理证实的喉鳞状细胞癌标本和邻近的正常黏膜组织标本与基因表达谱芯片进行杂交,利用激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片杂交信号,获得样品中基因序列及表达信息。结果:对比2例喉癌和邻近正常组织的基因表达图谱,发现癌组织和正常组织存在差异表达,2例标本重复出现且差异表达的基因共74个,其中喉癌组织表达上调的基因(R 5)27个,表达下调的基因(0<R<0.2)47个。结论:利用基因表达谱芯片可以在喉鳞状细胞癌组织和邻近的正常组织之间一次比较7000多个基因表达变化,并能找出病理组织中表达异常的基因。

接头蛋白Crk Ⅰ在喉鳞癌中的表达及意义

目的:探讨接头蛋白Crk Ⅰ在喉鳞癌组织中的表达及意义;方法:采用免疫组化SP法,对54例喉鳞癌手术切除标本和22例癌旁正常组织进行检测,观察Crk Ⅰ在2种组织中的表达,分析Crk Ⅰ的表达与鳞癌临床分期、病理分级、肿瘤转移及生存时间的关系。结果:Crk Ⅰ在喉癌组织中主要表达于细胞质、细胞核可见少量表达、阳性率达64.8%,在癌旁正常组织中少量表达或无表达,2种组织中Crk Ⅰ表达阳性率比较,差异有统计学意义(χ~2=24.149,P<0.01);喉鳞癌组织中,有淋巴结转移者Crk Ⅰ蛋白阳性表达率为91.7%,与无淋巴结转移者的54.8%比较,差异有统计学意义(P<0.05);但Crk Ⅰ蛋白的阳性表达率在各年龄组、不同临床分期、病理分级及不同预后的喉鳞癌患者中比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:接头蛋白Crk Ⅰ可能在喉鳞癌细胞的发生、发展和转移中有重要意义。

声门上型喉鳞状细胞癌诱导化疗潜在靶向基因的初步分析

目的 利用基因表达谱芯片,寻找声门上型喉鳞状细胞癌（简称声门上型喉癌）紫杉醇＋顺铂＋5氟尿嘧啶（TPF）诱导化疗敏感性的差异表达基因,探讨声门上型喉癌诱导化疗潜在的功能性靶向基因.方法 选取11例声门上型喉癌患者治疗前的新鲜肿瘤标本,分为化疗敏感组（7例）和不敏感组（4例）.采用Illumina人类全基因组表达谱芯片检测两组的表达差异,并对差异基因进行生物信息学在线分析.结果 共筛选出1 554个差异基因.经GO数据库分析,功能上调的集合主要包括：生物黏附、免疫系统发育及干细胞增殖等;下调的集合包括：细胞连接结构、磷代谢过程及细胞形态发生相关分化等集合.经KEGG数据库分析,上调通路主要有：P53通路、细胞黏附分子、Ras信号通路等.下调通路主要有：黏着斑、胞吞作用、ErbB信号通路等.其中MAPK10、PIK3R5、JUN等基因表达有显著差异且有生物学意义.结论 通过对化疗敏感与不敏感组的差异表达研究,功能核心基因MAPK10、PIK3R5、JUN等可能是声门上型喉癌诱导化疗敏感性相关的潜在功能性基因.

复发喉鳞状细胞癌相关基因表达谱研究

目的 :筛选与复发喉鳞状细胞癌相关的基因。方法 :用包含 18 0 0 0个cDNA的基因芯片法检测 2例复发喉鳞状细胞癌标本的癌组织及喉正常黏膜组织mRNA表达谱 ,通过对比分析寻找与复发喉鳞状细胞癌相关的基因。结果 :①重复且相差 3倍以上差异表达基因共 2 18个 ,其中喉癌组织表达上调的基因 137个 ,表达下调的基因 81个 ;②表达相差 10倍以上的基因 4个 ,分别为U 0 2 5 70、AW 86 3712、AA5 2 3939和NM_0 14 381。结论 :复发喉鳞状细胞癌的发生是一个多基因表达失调的过程 。

6种基因蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:探讨p15、p16、Rb、p27、p53及PCNA基因蛋白在不同分期、不同部位和不同分级的喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达和临床意义。方法:用免疫组织化学染色SP法对65例LSCC进行染色,30例正常黏膜为对照组,检测p15、p16、Rb、p27、p53及PCNA基因蛋白的表达,并进行统计学分析。结果:6种基因蛋白的表达在正常黏膜和LSCC中的差异有统计学意义(均P<0.01)。且p15和p27表达不仅和LSCC生长部位相关,而且和临床分期、分化程度相关。p16蛋白表达与LSCC的病理分级呈负相关,PCNA蛋白的表达与LSCC的病理分级呈正相关,两者的表达均与临床分期和肿瘤生长部位无关。而LSCC生长越晚期,Rb、p53蛋白的表达,前者呈下降,后者呈上升状态,且p53蛋白的表达和恶性程度呈正相关。结论:p15和p27基因表达的缺失是LSCC发生发展的重要过程,对两者的检测在LSCC的治疗和预后方面有一定意义。p16和PCNA反映肿瘤细胞的增殖状态,与肿瘤的发生有关,与肿瘤的发展过程无关。而Rb、p53基因表达多与肿瘤的发展过程相关。

喉癌Hep2细胞系APAF-1表达及对5-Aza-CdR诱导凋亡敏感性的研究

目的:探讨喉癌中APAF-1基因的表达及其对5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-az-a-2′-deoxycitydine,5-Aza-CdR)诱导的Hep2细胞系凋亡的影响。方法:不同浓度5-Aza-CdR(5×10-8、10-7、2×10-7和3×10-7mol/L)处理体外培养的Hep2细胞后,用流式细胞仪检测处理72h的细胞周期分布和细胞凋亡率变化;通过RT-PCR及免疫组织化学技术检测APAF-1基因在喉癌中的表达情况,并建立APAF-1瞬时过度表达系统,观察在APAF-1过度表达情况下,5-Aza-CdR对Hep2细胞凋亡的影响。结果:10-7mol/L5-Aza-CdR处理Hep2细胞72h后,凋亡率由对照组的1·07%增加到13·96%,且发生G1期细胞周期阻滞;喉鳞癌组织中APAF-1mRNA和蛋白表达都明显下调,分别为16/42、14/31,且未发现APAF-1表达与肿瘤的分化程度具有相关性,P=0·093;在10-7mol/L浓度5-Aza-CdR诱导下,APAF-1过度表达组Hep2细胞系凋亡率由空白对照组的12·46%及空载体转染组的14·74%增高到28·64%,且发生S期细胞周期阻滞。结论:过度表达APAF-1基因可以明显增加Hep2细胞系对去甲基化药物5-Aza-CdR诱导的凋亡敏感性。

利用高通量转录组测序数据预测喉鳞状细胞癌转录组新长链非编码RNA的初步研究

目的 利用链特异性转录组测序（RNA-Seq）技术,通过生物信息学手段,筛选并鉴定喉鳞状细胞癌（鳞癌）患者转录组中新的长链非编码RNA并对其进行差异表达分析,为进一步阐明喉鳞癌发病的分子机制提供基础.方法 选取10例喉鳞癌患者的肿瘤组织并提取RNA,构建链特异性转录组文库,利用高通量测序平台进行测序.滤除低质量数据后进行比对组装,对得到的转录本进行分类和注释,采用优化的长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）识别流程鉴定喉鳞癌转录中新的LncRNA,并对其特征进行分析.结果 建立了一个优化的流程,从10个喉鳞癌转录组中,共发现了134条目前LncRNA数据库中未收录的新的LncRNA,并分析其长度分布、开放阅读框（open reading frame,ORF）长度、表达差异特征.结论 通过高通量测序手段从喉鳞癌转录组中预测得到新的及其差异表达的LncRNA,可能为喉鳞癌LncRNA的生物信息学分析建立一个较好的流程.

喉鳞状细胞癌中BAG-1和p53基因的表达及其临床意义

目的:研究BAG-1和p53基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达,探讨BAG-1在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用及与p53的关系。方法:运用免疫组织化学SP技术,检测40例喉鳞状细胞癌组织,27例喉癌旁正常组织及20例声带息肉组织中BAG-1与p53的表达。结果:BAG-1在喉癌中表达阳性率为72.5%,较喉癌旁组织(18.5%)、声带息肉组织(20.0%)高(P<0.05),其表达与预后呈负相关(P<0.05);p53在喉癌中表达阳性率为65.0%,而在喉癌旁组织和声带息肉组织中均无表达,与在喉癌组织中的表达相比差异有统计学意义(P<0.05);其表达与病理分化程度、颈淋巴结转移及预后呈负相关(P<0.05);在喉癌组织中BAG-1与p53表达之间未见显著性相关(P>0.05)。结论:BAG-1和p53基因的过度表达与喉鳞状细胞癌的发生、发展存在一定的关系。BAG-1可作为早期诊断喉癌的一种生物标记,尤其是细胞核BAG-1定位可作为一种不良预后的预测因子;p53表达与喉癌颈淋巴结转移有关,可单独作为喉癌的预后指标。

iNOS在喉癌中的表达及其临床意义

目的 :探讨诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)在喉癌中的表达及其临床意义。方法 :采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术检测 40例不同病理分化程度、临床分期的喉鳞癌组织、癌旁组织及 1 0例喉乳头状瘤、7例正常喉黏膜中诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)mRNA的表达。结果 :喉癌组织iNOSmRNA阳性表达率为 85.0 0 % ,较对照组癌旁组织 ( 2 0 .0 0 % )、良性肿瘤组 ( 4 0 .0 0 % )、正常人组 ( 0 7)明显增高 (P <0 .0 0 0 1 ,P <0 .0 0 5,P <0 .0 0 0 1 ) ,有淋巴结转移组 ( 1 9 1 9)显著高于无淋巴结转移组 ( 71 .42 % ) (P <0 .0 5) ,iNOSmRNA阳性表达与肿瘤原发部位及T分级无关 ,与细胞分化程度呈负相关。结论 :喉癌组织中存在iNOS ,它可能通过合成一氧化氮 (NO)在分子水平参与了喉癌的发生、发展。