Cloning and Characterization of a Novel cDNA Encoding Late Embryogenesis-Abundant Protein 5 Like (LEA-5) Gene from Cara Cara Navel Orange Fruit (Citrus sinensis Osbeck)

LEA5 gene was postulated related with both stress and hormone responses. In an attempt to find genes exclusively expressed during fruit ripening of Cara Cara navel orange, a novel cDNA clone encoding late embryogenesis-abundant protein 5 like gene （CitLEA5-1） was obtained. It was 582 bp in length, containing 97 deduced amino acids. Compared with the stress-induced LEA5 from leaves of Citrus sinensis, CitLEA5-1 had a shorter 3′ untranslated region （UTR）. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that CitLEA5-1 was transcriptional regulated during fruit ripening of Cara Cara navel orange.

转晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因棉花及抗旱性分析

本研究将紫杆柽柳(Tamarix and rossowii Litv)晚期胚胎发生丰富蛋白(LEADQ663481)基因导入新疆早熟棉新陆早18号,通过冬季海南加代、夏季新疆继代的方法获得T3代转基因棉花株系。从40株大田卡那霉素检测阳性植株中,经过PCR筛选证明3株为阳性的转化株。在室内条件下,对转化株幼苗进行水培实验,并用12%(w/v)PEG-6000处理12h模拟干旱胁迫。结果显示,干旱胁迫之后,转LEA基因棉花基因表达量显著增加;丙二醛生成量显著降低;游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的生成量显著增加;棉花表型分析也证明了转LEA基因棉花抗旱性有提高。培养45d后,转LEA基因棉花的生物量高于非转基因棉花。本研究结果表明,在干旱胁迫条件下,转LEA基因棉花表现出了优良的生长和生理优势,显示出转LEA基因棉花能提高棉花的抗旱能力。

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化

胚胎晚期富集蛋白(LEA)广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。本研究利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆了一个LEA4类基因的开放阅读框(ORF),命名为Ms LEA4-4。该基因编码512个氨基酸,结构分析显示MsLEA4-4包含5个重复的由11个氨基酸TAQAAKEKTQQ组成的序列特征。利用实时荧光定量PCR检测了Ms LEA4-4在不同逆境下的表达量,结果显示,该基因受干旱、NaCl、Cu^(2+)、Zn^(2+)和外源ABA诱导表达上调,其中Na Cl胁迫2h、Cu2+和Zn2+胁迫8 h,Ms LEA4-4基因表达量最高;冷胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量随处理时间的延长呈逐渐上升趋势,表明该基因可能参与了紫花苜蓿的抗逆性调控。构建植物超表达载体p CAMBIA3301-Ms LEA4-4,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过草铵膦(PPT)筛选和分子检测,7株抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索Ms LEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。

转TaLEA基因小黑杨抗寒株系的筛选

为验证转TaLEA基因小黑杨耐低温能力并筛选抗寒的优良株系,对11个转LEA基因小黑杨株系与非转基因野生型小黑杨对照(WT)进行了低温胁迫处理,测定其丙二醛(MDA)的质量摩尔浓度、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、叶绿素质量分数、冷害指数等。结果表明:低温胁迫条件下,除XL09外,其余各转基因株系的MDA质量摩尔浓度均低于WT,转基因株系MDA的质量摩尔浓度平均值低于WT的16.5%;抗氧化酶类活性在低温胁迫下仅XL10和XL11株系相对较高;叶绿素质量分数除XL01略低于WT外,其余转基因株系均高于WT,转基因株系叶绿素的质量分数平均值为35.1 mg.g-1,高于WT的6.4%;冷害指数方面,各转基因株系中除XL03高于WT外,其余均低于WT。采用隶属函数法综合评价各株系的抗寒性,从强到弱排序为:XL11>XL10>XL14>XL04>XL07>XL03>XL13>WT>XL06>XL01>XL05>XL09。外源基因LEA的导入不同程度地提高了小黑杨的抗寒性,其中XL11、XL10、XL14、XL04株系耐低温能力较强。

水稻OsLEA5c基因的克隆、表达和抗逆性分析

为了研究水稻胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA5c 的抗逆性，利用 RT PCR技术从水稻中克隆到OsLEA5c的 cDNA。序列分析表明，OsLEA5c基因的读码框为456 bp，编码1个由151个氨基酸残基组成的蛋白。蛋白分子量为16.55 kD，等电点为5.07。OsLEA5c蛋白的平均亲水系数（GRAVY）为0.020，为疏水蛋白。OsLEA5c蛋白的44－140位氨基酸残基形成 LEA_2结构域。进化树分析表明，OsLEA5 c属于第5组LEA蛋白的C亚组。OsLEA5 c与5 C亚组LEA蛋白的氨基酸一致性为45.14％～61.59％。利用基因重组技术构建的原核表达载体 pET32a Os-LEA5c，转化到E．coli BL21 pLysS菌株中，诱导得到34 kD的融合蛋白。OsLEA5c在大肠杆菌中的表达增加了大肠杆菌对高温、高盐、高渗透压和反复冻融的抗性。OsLEA5c 基因在水稻抗逆和种子成熟脱水过程中发挥重要作用。

水稻OsLEA19a基因在大肠杆菌中的表达和抗逆性分析

根据胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA19a的读码框序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pET30a-OsLEA19a,并将重组质粒转化到E.coli BL21中。优化诱导OsLEA19a表达的条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。OsLEA19a融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析表明,诱导蛋白表达的最适条件是37℃、4 h,融合蛋白的大小大约为30 kDa。抗逆性分析表明,OsLEA19a的表达能增强大肠杆菌对高盐、高渗透压、高温和低温等非生物胁迫的抗性。

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。

大豆Em(LEA1)蛋白保守结构域的结构和聚集特性

采用圆二色谱(CD)和核磁共振波谱(NMR)方法研究了大豆Em(LEA1)蛋白保守基序Em-C和Em-2M多肽在不同环境中的结构及聚集行为。研究表明,在水和DMPG溶液中,两种多肽主要以无规结构形式存在。在50%TFE溶液中,Em-C多肽折叠结构增加,含疏水残基的部分区域可能形成α-螺旋结构,且分子以二聚体形式存在;而Em-2M则以单体形式存在,且有序结构较少。以上结果表明,环境变化可能导致两种多肽的空间结构和聚集行为改变,这有助于理解Em蛋白在不同环境中的结构特点,及其重要区域在全长蛋白中所起的作用。

扁蓿豆MrLEA2基因的克隆和原核表达

从扁蓿豆(Medicago ruthenica L.)幼苗中克隆到一个编码晚期胚胎发生丰富蛋白的基因MrLEA2,Pfam数据库检索表明其编码产物属于LEA_2蛋白家族。半定量RT-PCR分析发现MrLEA2在幼苗中表达水平不受非生物胁迫(脱水、高盐和低温)和脱落酸诱导。利用MrLEA2基因构建原核表达载体,在大肠杆菌中实现了过量表达。通过斑点试验和菌落计数实验,对过量表达MrLEA2蛋白的大肠杆菌细胞在高盐(0.5mol/L NaCl和0.5mol/L KCl)、55℃高温和-20℃冷冻胁迫处理下的生长存活情况检测发现,MrLEA2蛋白过量表达能够明显提高大肠杆菌对上述胁迫的耐受性。研究表明,MrLEA2蛋白对高盐和温度胁迫引起的细胞损伤具有保护作用。

花生中三个LEA基因的克隆与表达分析

胚胎发生晚期丰富蛋白(LEA)是一类受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究在转录组数据分析时,发现3个LEA基因在花生干旱胁迫时大量上调表达。利用RACE技术以及生物信息学方法,发现这三个基因分别属于LEA2、LEA3以及LEA4。通过序列比对进行进化分析,结果表明其均与Arachis duranensis,A.ipaensis相关基因具有极高相似度,印证了栽培花生来源于Arachis duranensis和A.ipaensis的研究结果。通过表达分析发现,正常状态下这三个基因在花生根、茎、叶中均有表达;干旱胁迫状态下,花生根部的LEA基因大量表达,暗示其在花生抗旱机制中发挥重要作用。本研究结果可为筛选新的抗旱花生种质提供理论依据。

OsLEA2基因在原核生物中的异源表达和抗性分析

为了研究胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA2的功能,利用PCR方法扩增目的基因,采用基因重组、蛋白质表达和抗逆性分析对OsLEA2基因进行研究。结果表明,构建的原核表达载体pET32a-OsLEA2,转化到E.coli BL21中,得到表达OsLEA2融合蛋白的工程菌;SDA-PAGE分析表明融合蛋白的分子量约为29.4 kDa。OsLEA2的表达增强了大肠杆菌对高盐、高温、低温和紫外照射等非生物胁迫的抗性。该研究为进一步改良作物品种、提高农作物的抗逆性奠定基础。

水稻干尖线虫Ab-lea基因在高渗透压下的表达

【目的】水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)在侵染寄主以前,能够以变渗隐生状态在土壤和种子中的高渗透压环境下长期存活,使防治该线虫极为困难。通常,非生物胁迫下,胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)的基因表达量会显著上调。作为逆境表达蛋白,LEA能在逆境下保护生物。为探究水稻干尖线虫LEA编码基因(Ab-lea)在高渗透压胁迫下的表达模式及功能,【方法】根据转录组数据克隆到Ab-lea。以无机溶剂饱和Mg SO4·7H2O溶液为高渗透压胁迫剂,对水稻干尖线虫进行高渗透压胁迫,240 min后该线虫进入变渗隐生。通过RT-PCR验证Ab-lea在线虫进入变渗隐生及维持变渗隐生过程中的表达特性。使用RNAi技术,探究该线虫Ab-lea沉默后,高渗透压胁迫下存活率变化。【结果】RT-PCR结果表明,Ab-lea在进入变渗隐生前期及维持变渗隐生过程中表达量上调。Ab-lea沉默后,水稻干尖线虫在进入变渗隐生后存活率显著下降。【结论】表明该基因可能参与调控水稻干尖线虫变渗隐生。本研究为进一步探究该线虫抗高渗透压胁迫的生理机制奠定基础,为防治该线虫提供新思路。

丹参晚期胚胎蛋白基因SmLEA的克隆及表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,发现一条序列与晚期胚胎丰富蛋白(late embryogenesis abundant)基因有较高的相似性,在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平克隆到该基因的全长(Genbank注册号:AY725206),命名为SmLEA。该序列全长739 bp,无内含子,包含1个长为495 bp的开放阅读框,编码164个氨基酸。序列比对结果显示,该序列与番茄的晚期胚胎丰富蛋白Lemmi9有较高的相似性(69%),推测该编码蛋白属于晚期胚胎蛋白LEA14家族成员。生物信息学显示,SmLEA所编码蛋白SmLEA的相对分子质量为17.34 kD,理论等电点为4.51,富含天冬氨酸及AS、IP、KV、VS、TIP肽段,定位于细胞质中,为稳定类蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,为组成型表达基因。

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。

花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因AhLEAL的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

低温、高盐和干旱等非生物胁迫严重影响花生的生长和产量,而花生中有关非生物胁迫的研究及抗性基因的挖掘较少。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是一类亲水性蛋白,其功能主要是参与调控植物应答脱水相关的非生物胁迫包括耐盐、抗旱和抗冻等。本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据cDNA文库中已知的胚胎发育晚期丰富蛋白基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因。该基因全长为555bp,开放阅读框为291bp,编码97个氨基酸。核苷酸序列比对表明,该基因与花生中已注册基因AhARG2(XM_016113504)同源性为100%,与AhLEA6-1(HM543588)同源性为99%。蛋白序列比对分析表明,该基因编码的蛋白与Genbank上已经注册的沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、牧豆树(Prosopis juliflora)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65%。我们将该基因命名为AhLEAL(Arachis hypogaea Late Embryogenesis Abundant Like)。预测该基因编码的蛋白可能定位于细胞液、线粒体、内质网和叶绿体中。荧光定量PCR结果显示,AhLEAL在花生叶片和根中的表达受低温和高盐胁迫的强烈诱导,在根中受干旱胁迫的强烈诱导,说明该基因可能参与了花生对三种非生物胁迫的适应性调控;此外,AhLEAL在花生叶片和根中的表达也明显受ABA的诱导,说明该基因对花生逆境胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。

OsLEA5c在大肠杆菌中的表达、纯化及对蛋白质的保护效应研究

为了研究OsLEA5c蛋白对其他蛋白的保护效应,在大肠杆菌DL21中异源表达OsLEA5c蛋白,采用HiTrap^(TM) chelating HP层析柱纯化OsLEA5c蛋白。纯化的OsLEA5c蛋白用于高温、脱水和冻融胁迫下对乳酸脱氢酶的保护效应研究。结果表明,在PBS缓冲体系中,50℃处理10、20、30 min后,乳酸脱氢酶的活性分别残留43.20%、24.53%、17.55%;而按1∶1的质量比加入纯化的OsLEA5c蛋白后,乳酸脱氢酶活性分别保留85.77%、74.24%、65.27%。干燥脱水5 h后,乳酸脱氢酶活性仅保留2.55%~4.19%;按2∶1、5∶1和10∶1的质量比加入OsLEA5c蛋白,乳酸脱氢酶活性分别保留17.59%、24.73%、36.39%。反复冻融5次,乳酸脱氢酶活性残留9.41%~12.14%;而按2∶1、5∶1和10∶1的质量比加入纯化的OsLEA5c蛋白,乳酸脱氢酶活性分别保留28.09%、69.44%、95.16%。表明OsLEA5c蛋白对其他蛋白质具有保护作用,能减少高温、脱水和冻融胁迫对蛋白质的损伤。

OsLEA2对乳酸脱氢酶的保护分析

在大肠杆菌DL21中表达胚胎发育后期丰富蛋白基因Os LEA2,用Hi TrapTMchelating HP层析柱纯化得到了Os LEA2蛋白。研究表明,高温会使乳酸脱氢酶的活性降低,高温处理时间的延长会增加对乳酸脱氢酶的损害;干燥脱水5 h后,乳酸脱氢酶活性几乎全部失活,其活性仅仅是未处理的3.06%;反复冻融也会降低乳酸脱氢酶的活性。在高温、脱水和冻融胁迫下,Os LEA2的加入能保护乳酸脱氢酶;随着Os LEA2的增加,乳酸脱氢酶的活性增加。因此,Os LEA2蛋白对乳酸脱氢酶具有保护作用,能减少高温、脱水和冻融对乳酸脱氢酶的损伤。

应用荧光光谱法研究植物LEA3蛋白11-氨基酸基序的保护功能

胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant,LEA)是增强生物抵抗干旱、低温和盐渍等多种胁迫的重要功能蛋白,但其保护机理仍不清楚。本文利用紫外光谱法证实,含多拷贝11-氨基酸基序的多肽(如PM2D和PM2E)可较好的保护经冻融的乳酸脱氢酶(LDH)活性。进一步通过荧光光谱法证实,含多拷贝11-氨基酸基序的多肽可通过多位点协同结合模式,稳定LDH酶的结构。而含低拷贝11-氨基酸基序的多肽(如PM2F和PM2G)与LDH酶只有一种结合位点,二者的结合强度较弱,因而不能表现出对LDH酶活性的保护作用。此外,含多拷贝11-氨基酸的多肽与海藻糖在保护LDH酶活性上存在协同作用,且二者有着不同的保护机理。

转MsLEA4-4基因拟南芥株系的耐盐性分析

为了深入研究紫花苜蓿(Medicago sativa)MsLEA4-4基因的抗逆性,本试验对前期获得的转MsLEA4-4基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行不同浓度盐胁迫处理,以验证MsLEA4-4基因在拟南芥植株体内的耐盐性。试验结果表明:盐胁迫后转基因株系的发芽率达到55%,比对照植株(Control plant,CK)高81%;转基因株系的鲜重、叶绿素含量均高于CK(P<0.05);盐胁迫后转基因株系的存活率比CK提高75.0%~81.3%;盐胁迫明显抑制根系生长,但转基因植株的侧根数量比CK多4~5根(P<0.05);盐胁迫后转基因株系体内的可溶性糖含量(P<0.05)和超氧化物歧化酶(P<0.01),过氧化氢酶(P<0.01),过氧化物酶(P<0.05)活性均高于CK,脯氨酸(P<0.01)和丙二醛(P<0.05)含量均低于CK。综上可得,MsLEA4-4基因参与了拟南芥体内的耐盐性调控,提高了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。本研究为进一步探索MsLEA4-4在转基因紫花苜蓿盐胁迫中的功能及培育耐盐性紫花苜蓿品种提供依据。