红花除虫菊和甘野菊的花粉采集与贮藏

花粉贮藏可有效解决远缘杂交亲本的花期不遇障碍,但是不同植物花粉合适的采集时机和适宜的贮藏技术差异较大。通过不同处理条件的花粉萌发率的检测,确定红花除虫菊[Pyrethrum coccineum(Willd.)Worosch.]和甘野菊[Dendranthema lavandulifolium var.seticuspe(Maxim.)Shih]的花粉最适合在其花粉期的第三天至第五天,于晴天10:00—13:00采集;花粉经干燥后,短期可贮于硫酸纸袋4℃冷藏,长期需置于-20℃、离心管内密封保存,90 d后仍能满足授粉的需要,该结果为远缘杂交奠定了基础。

甘菊ClCOL16基因的克隆与功能初步研究

CO基因通过光周期途径整合昼夜规律、光信号以及分生组织相关基因来调节开花时间,在植物成花过程中起着至关重要的作用。该研究利用RT-PCR法从甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中克隆得到一个CO家族基因,命名为ClCOL16(GenBank登录号:AOA52174);采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,抗性筛选并经过PCR鉴定得到T3代转基因植株;随机抽取6个转基因拟南芥株系与野生型(WT)共同于长日照环境(16 h/8 h光暗交替)培养,观察其表型,并于定植后37 d检测WT和转基因拟南芥植株叶片的ClCOL16表达,以明确甘菊ClCOL16基因在植物光周期调控开花中的作用,为进一步解析菊花花期调控机理奠定基础。结果显示:(1)甘菊ClCOL16基因含有一个1 278 bp的编码框,编码425个氨基酸;ClCOL16编码蛋白含有一个B-box和一个CCT保守结构域,为典型的CO家族第Ⅲ组成员。(2)NCBI同源比对分析显示,ClCOL16蛋白与除虫菊COL16蛋白(GenBank登录号:GEZ38716.1)的一致性最高,达到94.38%。(3)荧光定量分析显示,ClCOL16基因为组成型表达,在叶片中的表达量最高,其表达受生物钟调节,在短日照调控下表现出明显的昼夜节律。(4)异位表达结果显示,与野生型拟南芥相比,转ClCOL16基因拟南芥株系的花期提前了7 d,莲座叶减少了3~4片,叶片中ClCOL16基因的表达量均显著提高,表明ClCOL16基因能够促进转基因拟南芥开花。研究推测,甘菊ClCOL16基因可能是甘菊响应光信号、参与菊花光周期开花途径调控的重要基因。

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT-PCR和PCR-RACE技术,从菊科植物甘菊(Dendranthema lavandulifolium)中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的同源基因,分别命名为D lBADH1和D lBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。D lBADH1的cDNA全长1821 bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;D lBADH2全长1918 bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97%,推导的氨基酸序列的同源性为98%。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64%以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT-PCR-Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。

植物开花基因新资源:甘菊中花分生组织决定基因DFL

LFY基因是花分生组织特征基因,不仅决定花分生组织的形成,而且控制着开花时间。在利用基因工程进行植物花期调控方面具有深远的影响。本文作者利用RT-PCR、PCR-RACE技术,从菊科菊属植物甘菊(Dendranthemalavandulifolium)中分离到了LFY同源基因DFL,基因登录号AY559245。为植物花发育的研究及观赏植物的花期调控提供了新的基因资源。

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。

甘菊下胚轴离体再生体系的建立

以甘菊下胚轴为外植体,通过器官发生途径诱导不定芽分化,建立了甘菊下胚轴高效再生体系,为甘菊遗传转化体系的建立奠定了基础。结果表明:将甘菊种子播种于MS培养基上,置于黑暗条件下培养7d可以迅速获得大量下胚轴;下胚轴在MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA的培养基上培养15d后,愈伤组织形成率最高为86.66%,愈伤组织呈淡黄色,大小一致;将愈伤组织转接到MS培养基中培养30d左右即可分化不定芽,不定芽分化率达25.50%,平均每个外植体产生不定芽数目为4.25个;不定芽在添加0.1mg/LNAA的1/2MS培养基中培养15d后,生根率达到100%。生根试管苗出瓶后,经过适宜培养,均可以获得健壮的开花植株。

秋水仙素诱导甘菊多倍体研究

以甘菊种子为试验材料,研究了不同秋水仙素浓度和处理时间对甘菊多倍体诱导的影响。结果表明:500mg/L的秋水仙素水溶液浸渍种子12h,变异率为23%,达到了极显著差异。根尖染色体压片检查表明,四倍体染色体数为2n=4x=36,并且获得了同源四倍体甘菊1株(2n=4x=36)。四倍体植株表现出叶片下表皮气孔保卫细胞变大,叶绿体数变多,叶片变小,花径变大,舌状花数目减少,管状花数目增多。

甘菊中FLORICAULA/LEAFY同源基因DFL的基因组序列(登录号:AY672542)(英文)

There are many genes which control the flowering development. FLORICAULA/LEAFY gene is one of controlling flower meristem identity of plant. We isolated the homologue gene (DFL) of FLORICAULA/LEAFY from D. lavandulifolium. The genomic sequence of DFL include three extron and two intron. The number and position of introns are conserved with other most FLORICAULA/LEAFY homologue. This result is helpful for better understanding the mechanisms of plant flowering and may have important effect in the forestry and angriculture.

甘菊内参基因ClTUA的克隆与表达分析

根据前期工作已获得的甘菊α-tubulin基因EST序列,使用RACE技术获得了该基因的全长序列,命名为ClTUA。生物信息学分析表明,ClTUA基因全长cDNA序列为1580bp,编码432个氨基酸残基。利用MEGA4.0软件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现,其为植物中Ⅰ类α-tubulin基因。RT-PCR分析发现:ClTUA基因不仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达,而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达;而作为对照的两个内参基因,ClActin和26SrRNA基因在不同非生物胁迫下表达稳定,但在不同生长发育阶段的样本中表达强度不同。这一结果表明,ClTUA基因的表达稳定性优于ClActin和甘菊26SrRNA基因,可以作为内参基因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。

新的BADH同源基因:甘菊BADH基因

BADH基因是重要的渗透胁迫抗性基因,在植物的抗性分子育种方面具有重要作用。本文作者利用PCR、RT-PCR、PCR-RACE技术,从菊科菊属植物甘菊(Dendranthemalavandulifolium(Fisch.)LingetShih)中克隆到2个BADH基因的同源基因——DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为:DQ011151和DQ011152。

北野菊黄酮类成分研究

从北野菊（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ）全草中分得四个黄酮类化合物。经光谱（ＵＶ，ＩＲ，氢谱，碳谱，质谱等）方法鉴定其结构，分别为木樨草素（Ｉ），洋芹素（Ｉ），金合欢素７ＯαＬ鼠李糖基（１→６）βＤ葡萄糖甙（ＩＩ）和金合欢素７ＯαＬ鼠李糖基（１→６）［２Ｏ乙酰基βＤ葡萄糖基（１→２）］βＤ葡萄糖甙（ＩＶ）。其中，Ｉ和Ｉ为首次从该植物中得到，ＩＶ为一个新化合物。

甘菊cDNA-AFLP反应体系的优化

以甘菊为试验材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜甘菊的cDNA-AFLP分析体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明:适用于甘菊叶片总RNA提取的方法为改进的Trizol法;酶切连接采用一步法,dscDNA酶切用量为300ng,酶切连接时间为8h;PCR选择性扩增反应时,反应体系中最佳组合为:引物浓度0.4mM、Mg2+浓度1.25mM、Taq酶浓度0.9U、dNTP浓度0.3mM。

盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因表达及甜菜碱含量的变化

利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和雷氏盐紫外分光光度计法分别测定了400mmol/L NaCl胁迫处理0,0.5h,2h,12h,1d,2d,4d,6d,8d,10d和12d,甘菊叶片中BADH基因表达和甜菜碱含量的变化,并讨论了二者间的相互作用关系。试验结果表明,在高盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因和甜菜碱含量均呈现先上升后下降的趋势。在处理初期(0.5h和2h)BADH基因的表达量与对照相比略有下降,此后随处理时间的增加BADH基因表达持续增大,在胁迫处理6d时BADH基因表达量最大为对照的4.6倍,6d之后BADH基因表达量逐渐降低。甜菜碱含量在NaCl处理0.5h突然增大以应对胁迫反应,此后其含量出现了小幅的震荡上升,在胁迫处理4d时达到了最大值,此后随胁迫处理时间的增加甜菜碱含量逐渐降低。二者之间的变化并不是同步的,而是存在滞后性,分析认为甘菊叶片中BADH基因表达与甜菜碱积累间存在相互抑制的作用。

野生地被植物蛇莓和甘野菊的抗旱性研究

研究了野生地被蛇莓和甘野菊在土壤干旱胁迫下土壤含水量、叶片细胞膜透性、叶片相对含水量、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白质、游离脯胺酸、过氧化物酶(POD)随胁迫强度的变化。结果表明:随着胁迫的加深,甘野菊出现胁迫症状要早于蛇莓,但最后受到的胁迫程度较轻,表明甘野菊的抗旱性要强于蛇莓。

甘菊挥发油化学组成及其对烟草甲与赤拟谷盗的杀虫活性

本试验研究了甘菊挥发油的化学组成及其对烟草甲和赤拟谷盗两种常见仓储害虫成虫的熏蒸、触杀和驱避作用。采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,GC/MS法分析挥发油的成分及其相对含量。结果表明,从甘菊挥发油中鉴定出了31种化合物,主要组分为樟脑(29.99%)、桉叶油醇(16.87%)、β-水芹烯(4.63%)、顺马鞭草烯醇(4.41%)和顺-β-松油醇(4.04%);生物活性测试结果显示,甘菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗具有一定的触杀活性(LD 50分别为24.09μg/头和49.95μg/头)和熏蒸活性(LC50分别为28.67 mg/L和14.40 mg/L)。同时,甘菊挥发油对赤拟谷盗表现出显著的驱避活性,对烟草甲驱避效果不明显。本试验首次研究了我国菊科菊属植物甘菊的挥发油的化学组成和杀虫活性,结果提示该挥发油对烟草甲和赤拟谷盗具有一定杀虫、驱避活性和防治潜力。

神农香菊黄酮类化合物酶促提取及抗氧化性研究

目的对神农香菊进行纤维素酶促提取黄酮类化合物研究并检测其抗氧化活性。方法采用亚硝酸钠—硝酸铝比色法测定神农香菊加酶提取物与不加酶对照提取物的总黄酮含量;采用清除邻二氮菲体系羟基自由基实验,与维生素C(Vc)对比来评价其抗氧化性。结果纤维素酶促提取神农香菊黄酮类化合物的产率为10.05%,不加酶对照提取物的黄酮类化合物产率为6.15%;在清除邻二氮菲体系羟基自由基实验中,酶促提取的神农香菊黄酮类化合物浓度为0.175 mg.mL-1时,清除率达56.09%;结论添加纤维素酶进行预处理,能提高神农香菊黄酮类化合物产率;且得到的神农香菊黄酮类化合物具有强抗氧化性,相同浓度时清除自由基能力强于Vc,一定范围内随浓度增加、清除自由基能力增强。

抗生素对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响

以甘菊叶片为外植体,尝试不同浓度羧苄青霉素(Carb)、卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hyg)对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明,潮霉素和卡那霉素都对愈伤组织诱导有抑制作用;对不定芽分化而言,以潮霉素和卡那霉素作为抗性筛选标记时,选择压都以5 mg.L-1为宜。羧苄青霉素的抑菌效果较好,质量浓度应在300～500 mg.L-1范围;潮霉素3 mg.L-1、卡那霉素20 mg.L-1为合适的转化植株生根培养的抗生素临界浓度。

甘菊遗传转化再生体系的建立

[目的]建立高效稳定的甘菊再生体系,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。[方法]以甘菊无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。[结果]在5种芽诱导培养基中,MS3(MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L)的再生频率最高,可达98%,其不定芽生根率可达100%。培养35 d后,添加5和10 mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为11.3%和1.0%,添加15和20 mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加0.5 mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为8.7%,添加1 mg/L草丁膦的培养基上没有芽的再生,添加1.5和2.0 mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓度分别为8.0和0.8 mg/L。[结论]该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。

甘菊种子萌发特性及自然条件下生长发育规律

对甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino]种子萌发特性和自然条件下生长发育规律进行了试验观察,发现不同栽培基质及不同储藏时间对甘菊种子萌发率均有影响,在MS培养基上播种甘菊种子萌发率最高,可达90%左右。甘菊种子无休眠现象,采收后立即播种和次年春季播种萌发率均可达90%左右。甘菊种子不耐储藏,储藏至第3年秋季播种,萌发率仅为30%。自然条件下,5月至8月底是甘菊植株的营养生长时期,在此期间,甘菊株高、茎粗、冠幅、叶片数及分枝数一直处于增长状态;9月份当日照长度缩短至13 h时,甘菊开始现蕾,这表明13 h光照/11 h黑暗可能为甘菊现蕾的临界日长。