变异链球菌ldh-luc荧光报告株的生物学活性检测

目的探讨本课题组前期所构建的变异链球菌(S.mutans)ldh-luc荧光报告株在浮游态及生物膜状态下的活性及代谢状态的有效性,为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础。方法采用生长曲线、扫描电子显微镜、活菌菌落计数等方法研究浮游态及生物膜状态下S.mutans ldh-luc荧光报告株的生长活性及代谢状态,并测定荧光报告株的荧光活性。结果S.mutans ldh-luc荧光报告株和野生株生长趋势一致,生物膜内可培养活菌数无差别(4h:F=2.13,P>0.05;12 h:F=1.45,P>0.05;24 h:F=2.72,P>0.05;48 h:F=1.85,P>0.05),SEM检测结果显示4、12和24 h生物膜形成能力无差异;S.mutans ldh-luc荧光报告株从对数生长早期到平台早期荧光表达稳定,荧光量能实时反映活菌数量。结论S.mutans ldh-luc荧光报告株和野生株生长能力相似,具有稳定的荧光活性,荧光量能准确反映细菌活菌数量,提示可用S.mutans ldh-luc荧光报告株代替野生菌株进行相关实验研究,并可用于实时观测抗菌剂对其的作用。

变异链球菌ldh-luc基因荧光报告株对氯己定的敏感性实验研究

目的:探讨变异链球菌ldh-luc基因荧光报告株(荧光报告株)对氯己定的敏感性。方法:将变异链球菌荧光报告株S.mutans ldh-luc和野生菌株分别以浮离态和生物膜态培养于BHI,菌落计数法(CFU)检测氯己定对2种菌株的最小抑制浓度(MIC)、RLU、A_(600),以观测其生长状态及荧光活性的变化及相互关系。结果:氯己定对S. mutans ldh-luc基因荧光报告株和野生株的MICs均为(0. 25±0. 39)μg/ml。氯己定作用30 min后,浮游态和24 h生物膜S. mutans ldh-luc基因荧光报告株的RLU、A_(600)、CFU呈下降趋势;作用60 min后,RLU、CFU下降至检测水平以下,去除氯己定,加入BHI培养基培养90 min,仍未检出RLU,氯己定作用前后的差异具有统计学意义(P <0. 05)。结论:S. mutans ldh-luc基因荧光报告株能准确反映氯己定对生物膜中细菌的作用。

一种检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株的构建

目的:构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法:首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因copA的启动子融合构建响应铜离子的CopAp::gfpmut2-pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌(E.coli)MC4100体内负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件,并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果:相对野生型菌株,E.coliΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌对铜离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05~2.5μmol/L(0.0032~0.16 mg/L)Cu2+;与原子吸收光谱法相比,其对生活饮用水中0.05 mg/L和1 mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论:本研究构建报告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定了技术基础。

变形链球菌荧光报告株的构建和鉴定

目的探讨变形链球菌(S.mutans)荧光素酶(luc)基因报告株构建方法,拟为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础。方法将S.mutans UA159乳酸脱氢酶(ldh)基因及其上游部分约1100000片段克隆至自杀质粒pFW5-luc的多克隆位点,构建重组质粒,并经酶切和测序证实。采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和S.mutans UA159同源序列的单次交换。结果经过聚合酶链反应(PCR)和测序分析,筛选出具有报告活性的S.mutans ldh-luc基因荧光报告株。结论成功构建了S.mutans ldh-luc基因荧光报告株。

变异链球菌绿色荧光蛋白报告株在双菌种生物膜研究的应用

目的探讨变异链球菌(S.mutans)绿色荧光蛋白(GFP)报告株在单、双菌种生物膜的形成、代谢和抗药性研究的应用。方法采用基因重组技术构建S.mutansGFP报告株C67-1pDM15和UA159pDM15;通过荧光显微镜和荧光光度计,评估报告株转化效率、生长能力和荧光表达规律;构建S.mutansGFP报告株与戈登链球菌(S.gordonii)的单、双菌种生物膜,比较单、双菌种生物膜中S.mutans的生物膜形态、糖代谢活力及氯已定(CHX)作用下的抗药性差异。数据运用单因素方差分析、Pearson相关性分析与独立样本t检验进行统计学分析。结果S.mutansGFP报告株可稳定地表达gfp基因,生长能力和生物膜形成能力与野生株相似;生物膜加入0.2%的葡萄糖后荧光量迅速增加,可检测细菌代谢改变,4h的相对荧光增长值(ΔRLU)可反映生物膜量,二者显著相关(r=0.9818~0.9985,P<0.001);S.gordonii改变S.mutansC67-1和UA159的生物膜结构,抑制UA159菌株生物膜的形成;剩余荧光增长率[ΔRLU(%)]反映耐药能力,单菌种生物膜C67-1和UA159的ΔRLU(%)相似,分别为(70.2±8.0)%和(72.3±7.9)%(t=-0.521,P=0.630),在双菌种生物膜中S.mutans的ΔRLU(%)发生改变,与各自单菌种生物膜相比差异有统计学意义:C67-1升高至(85.6±4.3)%(t=-2.872,P=0.045),UA159降低至(41.2±10.1)%(t=3.551,P=0.024)。结论S.gordonii对S.mutans生物膜形成能力和抗药性的改变具有亚型差异。GFP报告株可作为多菌种生物膜定量与空间结构研究的模式菌。