利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作的蛋白质

【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统(split-ubiquitin yeast membrane system),以小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)的外壳蛋白(CP)基因为诱饵对异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)c DNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds c DNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到p PR3-N文库载体上,构建得到以p PR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体p DHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选p PR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉c DNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology(GO)注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×106 cfu,文库实际扩增数量大于1.3×106 cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉c DNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体p DHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol?L-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉c DNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别受体的活性、水解酶活性、磷酸离子载体活性和叶酸运输活性等。参考KEGG数据库,这些蛋白参与的代谢途径有泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、花生四烯酸代谢途径、c AMP信号通路和模式识别受体的信号通路等。【结论】异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库的成功构建与筛选,为研究异沙叶蝉与小麦矮缩病毒的互作机制研究奠定了基础。

利用酵母双杂交膜系统筛选与小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白互作的异沙叶蝉蛋白

小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf,WBD)是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节[1]。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白(immunodominant membrane protein,IMP)与介体异沙叶蝉肌动蛋白互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。