ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。

Lef-1基因在棕色和白色羊驼皮肤差异表达

本实验旨在研究淋巴增强因子-1(Lef-1)在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位,探索其与毛色间的关系.采用实时荧光定量PCR、Western印迹以及免疫组织化学方法,研究白色和棕色羊驼皮肤中的mRNA、蛋白表达水平和定位.定量实时荧光PCR结果显示,Lef-1在棕色羊驼皮肤组织相对基因表达量是3.372 7±0.198 9,在白色羊驼皮肤组织是1.000 3±0.022 7;Western印迹结果显示,在羊驼皮肤组织总蛋白中存在分子量约44 kD与兔抗Lef-1多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示,在棕色羊驼皮肤组织中多表达在毛球部,表皮也有分布,在白色羊驼皮肤组织中多表达在表皮,在棕色和白色羊驼皮肤组织中外根鞘都有较强表达.结果显示,Lef-1在棕色和白色羊驼皮肤的定位和含量存在差异,提示Lef-1可能影响了羊驼被毛颜色的形成.

小鼠出生后背部毛囊发育与Lef-1表达的研究

旨在研究Lef-1在小鼠背部毛囊生长周期中的表达规律及其与毛囊生长更替的关系。本试验采用石蜡切片HE染色、Western blotting以及免疫组织化学方法,研究小鼠毛囊的周期性变化,检测Lef-1在小鼠毛囊生长的不同时期皮肤组织中的蛋白表达水平,并对其进行组织定位。结果,昆明系小鼠毛囊生长呈周期性变化,处于不同生长时期的毛囊具有各期的特殊结构;Western blotting结果显示,在各阶段皮肤组织中存在Lef-1蛋白的表达,其在毛囊生长初期的表达量显著高于中期和末期;免疫组织化学结果显示,Lef-1在不同毛囊生长时期的皮脂腺、根鞘和真皮乳头均有不同程度的表达。Lef-1的表达与毛囊的周期性变化存在相关性。

β-catenin、LEF-1和PTEN在乳腺癌中的表达及意义

目的探讨β-链蛋白(β-catenin)、淋巴增强因子-1(LEF-1)和PTEN在乳腺癌组织中的表达情况,并分析三者表达的相关性及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测65例乳腺癌组织、30例乳腺纤维腺瘤组织和30例癌旁组织中β-catenin、LEF-1和PTEN的表达,分析三者在乳腺癌组织中表达的相关性及与临床病理特征的关系。结果在癌旁组织、乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织中β-catenin的阳性表达率分别为26.7%(8/30)、33.3%(10/30)、61.5%(40/65),LEF-1的阳性表达率分别为10.0%(3/30)、23.3%(7/30)、56.9%(37/65);PTEN的阳性表达率分别为90.0%(27/30)、83.3%(25/30)、41.5%(27/65),差异均有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌组织中三种蛋白的表达与年龄、肿瘤大小和肿瘤部位均无关(P>0.05),与TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。乳腺癌组织中β-catenin与LEF-1的表达呈正相关(r=0.845,P<0.05),β-catenin与PTEN的表达呈负相关(r=-0.874,P<0.05)。结论β-catenin、LEF-1和PTEN的异常表达与乳腺癌发生、发展、浸润、转移密切相关,三者的联合检测可能对判断乳腺癌生物学行为具有重要意义。

AEG-1和LEF-1在人结肠癌组织中的表达及其意义

目的:探讨星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)和淋巴增强因子-1(LEF-1)在人结肠癌组织中的表达,并分析其与临床病理特征的关系。方法:采用免疫组化法检测78例人结肠癌组织及78例相应癌旁正常组织中AEG-1和LEF-1的表达,并分析其临床病理意义。结果:AEG-1和LEF-1在结肠癌组织中的阳性表达率分别为73.1%(57/78)和67.9%(53/78),均明显高于癌旁正常组织(P<0.001)。AEG-1的表达与患者的组织分化程度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P<0.05),LEF-1的表达与患者的淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P<0.05)。结肠癌组织中AEG-1与LEF-1的表达呈正相关(r=0.326,P=0.004)。结论 :AEG-1和LEF-1的异常表达与结肠癌的发生、发展、浸润及转移密切相关,联合检测更有利于结肠癌的早期诊断及预后的判断。

β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响

目的探讨β-catenin依赖性LEF-1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响。方法利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF-1的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His中,脂质体法转染Hela细胞,G418筛选稳定表达目的基因的细胞株,Western blot鉴定目的基因的表达,MTT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,裸鼠体内成瘤实验检测β-catenin依赖性LEF-1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。结果成功构建LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达β-catenin依赖性LEF-1亚型的HeLa细胞株,转染后的细胞增殖速度加快,凋亡水平降低,体内成瘤能力加强。结论全长型LEF-亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用。

截短型LEF-1对HeLa细胞系生物学行为的影响及其相关机制

目的探讨淋巴细胞增强因子(LEF-1)截短亚型对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响及其分子机制。方法利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,将其插入pCDNA3.1/V5-His载体中构建截短型LEF-1的真核表达质粒,脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-Δ-LEF-1转染HeLa细胞,G418筛选稳定表达目的基因的细胞株,Western blot鉴定目的基因的表达,流式细胞术分析转染后细胞的增殖,凋亡和胞周期变化,以及CXCR4的表达情况;细胞外基质实验检测细胞的黏附能力;Transwell检测细胞的迁移能力。结果成功构建截短型LEF-1真核表达质粒,获得稳定表达LF-1截短亚型的HeLa细胞株,目的基因稳定表达,转染后的细胞增殖速度减慢,凋亡增加,细胞阻滞在G0/G1期,迁移能力降低,CXCR4的表达降低。结论 LEF-1截短亚型可以抑制HeLa细胞增殖和迁移,而这种调控作用可能和CXCR4的表达有关。

siRNA干扰LEF-1的表达对骨肉瘤细胞株F5M2侵袭和迁移的影响

目的:检测LEF-1在骨肉瘤细胞株F4和F5M2中的表达;探讨siRNA干扰前后对骨肉瘤细胞中LEF-1的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法:采用Western-blot及qRT-PCR检测具有不同转移能力的骨肉瘤细胞株(F4,F5M2)中LEF-1的表达水平;利用RNAi干扰技术将LEF-1 siRNA转染到F5M2细胞中,使用Western-blot检测转染LEF-1 siRNA后细胞中LEF-1蛋白的表达变化;Tanswell实验检测干扰LEF-1的表达对F5M2细胞侵袭和迁移的影响。结果:LEF-1在骨肉瘤细胞株F4,F5M2中差异表达,其中在F5M2细胞中的表达较高。在转染LEF-1 siRNA的F5M2细胞中,LEF-1蛋白表达水平显著降低。Tan-swell实验结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组F5M2细胞的侵袭和迁移能力显著降低。结论:LEF-1 siRNA可以下调骨肉瘤细胞中LEF-1的表达,抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移。LEF-1有可能成为骨肉瘤诊治的新靶点。

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响。方法利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP。用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Westernblot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,AnnexinV方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期。结果克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致。以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞,LEF-1截短型基因的表达产物通过Westernblot和流式细胞仪方法得到证实。转染SW480细胞,光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G0/1期发生阻滞。结论成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞Hela中可以表达。同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G0/1期。

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P<0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。

正常乳腺组织和浸润性乳腺癌组织中淋巴增强因子-1(LEF-1)转录因子的蛋白质表达水平的分析

目的通过实验对正常乳腺组织和浸润性乳腺癌组织中淋巴增强因子-1(LEF-1)转录因子的蛋白质表达水平进行分析,观察其差异。方法对从手术获得的新鲜乳腺组织做冰冻切片,经H&E染色分析鉴定出正常乳腺组织和乳腺浸润癌组织。用显微切割方法获取目标组织,再采用蛋白质免疫印迹法(Westen blot)检测正常乳腺组织和乳腺浸润癌组织中LEF-1转录因子的蛋白质表达差异。结果乳腺浸润癌组织中的LEF-1转录因子的蛋白质表达水平高于正常乳腺组织中的LEF-1转录因子的蛋白质表达水平。结论LEF-1转录因子的表达与乳腺癌的浸润相关,正常乳腺组织和乳腺浸润癌组织中的LEF-1转录因子的蛋白质表达水平的分析是研究LEF-1转录因子的调控作用机理的基础。

Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及其意义

目的研究Wnt信号通路相关因子β-catenin、GSK3β及Lef-1在卵巢癌中的表达及意义。方法应用免疫组织化学En Vision法检测218例人卵巢组织(包括正常组织,卵巢良性腺瘤及腺癌组织标本)中β-catenin、GSK3β及Lef-1的表达情况。结果β-catenin、GSK3β及Lef-1在癌组织中的表达明显高于腺瘤及正常组织(P<0.05);β-catenin及Lef-1表达与淋巴结转移及FIGO分期有关(P<0.05),与肿瘤分级无关(P>0.05);GSK3β与肿瘤分级、淋巴结转移及FIGO分期有关(P<0.05);β-catenin、GSK3β及Lef-1三者在癌中的表达均与卵巢癌的类型无关(P>0.05)。β-catenin表达与GSK3β和Lef-1表达均呈正相关(P<0.05)。结论 Wnt信号通路中β-catenin、GSK3β及LEF-1在卵巢癌的发生发展过程中起了一定的作用,卵巢癌的进展可能和β-catenin分别与GSK3β及LEF-1共同作用促进细胞的增殖有关,三者高表达与卵巢癌的预后有关。

β-catenin、LEF-1在唾液腺基底细胞腺瘤与腺样囊性癌鉴别诊断中的应用

目的探讨β-连环蛋白(β-catenin)、淋巴细胞增强因子1(LEF-1)在唾液腺基底细胞腺瘤(SBCA)与唾液腺腺样囊性癌(SACC)鉴别诊断中的应用价值。方法回顾性分析50例SBCA和41例SACC的临床病理资料,手术石蜡标本制作组织芯片,免疫组化检测β-catenin、LEF-1、Ki-67、S-100、CD117等标记物;FISH检测CTNNB1 (3p22)基因。结果β-catenin标记SBCA组49例(98.0%)呈现肿瘤细胞核阳性表达,中位计数15%;LEF-1标记48例(96.0%)SBCA呈现肿瘤细胞核阳性,中位计数20%;而40例SACC的肿瘤细胞核β-catenin及LEF-1均阴性,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SBCA和SACC容易误诊,β-catenin与LEF-1免疫标记物具有鉴别诊断价值,肿瘤细胞核阳性表达β-catenin、LEF-1支持诊断SBCA。

miR-300通过LEF-1调控卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的实验研究

目的探究miR-300介导LKF-1调控卵巢癌细胞增殖和凋亡的作用的机制。方法体外培养卵巢癌SK0V3细胞及正常卵巢上皮细胞,使用RT-PCR检测卵巢癌SK0V3细胞及正常卵巢上皮细胞中LEF-1及miR-300的表达情况;利用生物信息学软件预测LEF-1为miR-300的靶基因,并通过双荧光素酶等实验进行验证;将卵巢癌细胞分为空白对照组、空白转染组和miR-300抑制剂组。空白转染组使用miR-NC转染卵巢癌SKOV3细胞;miR-300抑制剂组采用miR-300 inhibitor转染细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;使用蛋A质印记检测各组细胞的增殖相关蛋白Ki-67表达情况;划痕实验法检测各组细胞迁移能力;使用蛋白质印记法检测迁移相关蛋白N-cadherin、E-cadherin表达情况;使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;使用蛋A质印记法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达情况。结果卵巢癌SK0V3细胞中LEF-1及miR-300的表达显著高于正常卵巢上皮细胞(T=4.528,P=0.017;T=6.328,P=0.017);相比空白对照组,空白转染组卵巢癌细胞增殖、迁移能力均无显著改变(P>0.05);相比空白转染组,miR-300抑制剂组Ki-67蛋内相对表达(T15.687;P=0.001)、增长率(T=9.732;P=0.024)、划痕愈合率(T=11.558;P=O.005)、E-cadherin蛋白相对表达(T=18.558;P=0.003)、Bcl-2蛋白相对表达(T=11.001;P=0.035)均显著降低;N-cadherin蛋白相对表达(T=22.478;P=0.001)、B ax蛋白相对表达(T=18.528;P=0.004)、细胞凋亡率(T=19.975;P=0.000)均显著升高。结论miR-300可以介导LEF-1抑制卵巢癌细胞增殖并促进其凋亡,其作用机制与调控增殖、凋亡相关蛋白和调控EMT过程相关。

美系大白猪LEF-1基因多态性与乳头数及生长性状的相关性研究

乳头数是衡量母猪整体繁殖性能的重要指标之一,增加母猪有效乳头数对于提高仔猪哺乳成活率具有重要意义。该试验采用PCR-RFLP技术,在美系大白(633头)群体中,对LEF-1基因的多态性进行检测和遗传效应分析。研究结果发现,在美系大白猪中检测到LEF-1基因三种基因型(AA、AG和GG基因型)的存在,但不同基因型个体之间乳头数无显著差异。

LEF-1协助TCF-1决定蛋白免疫应答中滤泡辅助T细胞的功能

目的探讨在蛋白免疫应答中转录因子TCF-1与LEF-1在滤泡辅助T细胞的分化与功能中的地位。方法对他莫昔芬诱导的条件敲除Tcf7与Lef1小鼠采用NP-KLH联合铝佐剂免疫或者NP-CGG联合完全弗氏佐剂免疫,分析应答过程中滤泡辅助T细胞的分化与功能,检测蛋白免疫应答中T细胞与B细胞TCF-1与LEF-1的表达量,并用脾脏嵌合小鼠模型验证TCF-1与LEF-1对于滤泡辅助T细胞功能的重要性。结果Tcf7与Lef1敲除小鼠的滤泡辅助T细胞分化是正常的,而B细胞应答严重缺陷。同时,Tcf7敲除小鼠的B细胞应答也是缺陷的,而Lef1敲除小鼠的B细胞应答是完整的;TCF-1与LEF-1在滤泡辅助T细胞中大量表达,而在B细胞中不表达;脾脏嵌合小鼠模型提示,在有正常滤泡辅助T细胞的帮助下,B细胞中TCF-1与LEF-1的缺失不会导致B细胞应答缺陷。结论在蛋白免疫应答中,TCF-1与LEF-1对于滤泡辅助T细胞的分化是不重要的,LEF-1协助TCF-1通过影响滤泡辅助T细胞的功能而影响B细胞应答。

退变腰椎间盘髓核组织HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ的表达及相关性

目的探讨腰椎间盘髓核组织高迁移率族蛋白B2(HMGB2)、淋巴样增强因子-1(LEF-1)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA及蛋白表达水平及其临床意义。方法收集腰椎间盘突出症患者手术摘除的髓核组织标本20例,根据术前腰椎MR片Pfirrmann分级标准均分为轻度退变组和重度退变组。qRT-PCR和Western boltting检测两组髓核组织HMGB2、LEF-1、ColⅡ的mRNA及蛋白表达水平,并分析其相关性。结果与轻度退变组比较,重度退变组HMGB2 mRNA及蛋白、COLⅡmRNA降低(P<0.05),LEF-1 mRNA升高(P<0.05)。HMGB2水平与ColⅡ水平呈正相关,与LEF-1水平呈负相关(P<0.05);LEF-1水平与ColⅡ水平呈负相关(P<0.05)。结论HMGB2、LEF-1、ColⅡ在不同退变程度腰椎间盘髓核组织中表达水平不同,提示其可能与椎间盘退变的发生相关。

流体剪切力对人牙周膜细胞LEF-1 mRNA表达影响研究

目的探讨人牙周膜细胞在流体剪切力作用下淋巴样增强因子-1(lymphoid enhancer factor-1,LEF-1)m RNA的表达。方法对人牙周膜细胞进行原代培养;通过流体剪切力加力系统对人牙周膜细胞施加1.2 Pa的流体剪切力,作用0、0.5、2、4、8 h后,用RT-PCR方法检测细胞受力前后LEF-1 m RNA的表达变化。结果人牙周膜细胞在1.2 Pa的流体剪切力作用8 h后,LEF-1 m RNA的表达升高。结论流体剪切力刺激活化了人牙周膜细胞中LEF-1的转录,LEF-1 m RNA的表达升高,可能是在剪切应力作用下Wnt信号通路的应答反应。

LEF-1的调控及其与肿瘤的关系研究进展

淋巴细胞增强因子(lymphoid enhancer factor,LEF-1)是Wnt信号通路中的一个重要调控因子。其异常表达对肿瘤细胞增殖和凋亡调控起关键作用。LEF-1作为Wnt信号通路核内的转录因子,还与T细胞受体α(TCRα)的增强子相互作用形成特定的构象,从而与其他因子结合共同调节基因的表达。同时,LEF-1为一多启动子基因,编码产生致瘤的全长形式的LEF-1和对Wnt信号通路起负向调控作用的截短形式的LEF-1。诸多研究结果表明肿瘤的发生发展与LEF/TCF各亚型的比例有关。就Wnt/LEF-1信号通路的调控以及与肿瘤的关系做一综述。

胰腺实性假乳头状肿瘤临床病理特征及LEF-1在其诊断中的应用价值

目的 探讨胰腺实性假乳头状肿瘤（SPN）的临床病理特征及淋巴细胞增强因子1（LEF-1）表达在其诊断中的应用价值.方法 收集并分析长海医院2000年1月至2015年12月间病理确诊为SPN的227例患者的临床病理资料,采用免疫组织化学方法检测132例SPN中LEF-1的表达,并与诊断SPN最常用的标志物β-catenin等的表达进行比较.结果 81.9%（186/227）的SPN发生于女性,发病平均年龄34岁;肿瘤平均直径为5.4 cm;48.5% SPN位于胰体尾部,33.0%位于胰头部;46.3%的肿瘤呈囊实性,42.3%呈实性,11.4%呈囊性.镜下观察有2例（0.9%）出现淋巴结转移,15例（6.6%）有脉管癌栓,14例（6.2%）有神经侵犯,13例（5.7%）侵犯邻近脏器.免疫组织化学结果显示,132例SPN中130例LEF-1呈核强阳性表达,阳性率为98.5%,而周围正常胰腺组织及胰腺其他肿瘤均未见LEF-1表达,特异性为100%.SPN的β-catenin阳性率为96.6%（144/149）,但有1例腺泡细胞癌呈阳性表达,特异性降低.165例术后平均随访51个月,截止至2016年10月31日,162例（98.2%）存活,5例出现肝脏转移,1例复发.结论 SPN好发于年轻女性,临床表现无特异性.LEF-1可作为SPN诊断和鉴别诊断的特异性标志物之一,且较β-catenin更为准确.