Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549细胞中肿瘤干细胞的活性

目的:研究let-7a-3p对人肺癌细胞A549的肿瘤干细胞活性的影响及其相关机制。方法:RT-qPCR法比较肺癌细胞系A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中let-7a-3p的水平。A549肺癌细胞株分别转染let-7a-3p模拟物(let-7a-3p mimics)和其阴性对照(negative control mimic),分别作为let-7a-3p组和negative control组,并设立未转染对照(non-transfected)组,采用RT-qPCR法检测各组细胞let-7a-3p的水平。瘤球形成实验检测3组肿瘤干细胞瘤球形成能力。流式细胞术检测肿瘤干细胞比例。Western blot法检测3组细胞NANOG、OCT4和胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的蛋白表达水平。运用生物信息学方法预测let-7a-3p的靶基因,双萤光素酶实验检测let-7a-3p与IGF1R的关系。Western blot法检测IGF1R过表达对let-7a-3p抑制肿瘤干细胞的拮抗作用。建立皮下移植瘤模型观察let-7a-3p的体内作用。结果:肺癌细胞系中let-7a-3p的表达水平均明显低于正常支气管上皮细胞系(P<0.01)。let-7a-3p组A549细胞中let-7a-3p的表达水平较non-transfected组明显上调(P<0.01)。瘤球形成实验发现,let-7a-3p组的瘤球数量明显低于non-transfected组。流式细胞术检测发现,let-7a-3p组的CD133^+细胞比例明显低于non-transfected组(P<0.01)。Western blot实验显示,let-7a-3p组的NANOG蛋白和OCT4蛋白表达量比non-transfected组明显降低(P<0.01)。生物信息学预测结果表明,let-7a-3p与IGF1R的3’-UTR区部分互补,IGF1R可能是let-7a-3p的靶基因。双萤光素酶实验证实,IGF1R为let-7a-3p的直接下游靶基因。Let-7a-3p组的IGF1R蛋白表达量明显降低(P<0.01)。Let-7a-3p组的皮下移植瘤明显小于non-transfected组。结论:let-7a-3p可能通过降低下游靶基因IGF1R的水平影响肺癌干细胞相关蛋白表达,抑制肺癌干细胞潜能。

宫颈鳞癌患者血浆miRNA let-7a-3p表达及其临床意义

子宫颈鳞癌在妇科恶性肿瘤最常见,病死率也高,每年全球新发病例超45万之多,是严重威胁女性健康的恶性疾病之一,近年研究发现宫颈癌发病逐渐趋于年轻化[1],其也是我国重点防治癌症之一。宫颈癌的发生是一个多因素、多阶段的发展过程,因此尽早诊断,及时采取相应治疗措施,是降低宫颈癌死亡率以及改善患者生活质量的关键。人乳头状瘤病毒(HPV)感染,尤其是高危型HPV的感染是导致宫颈癌发生的主要危险因素。

Let-7a-3p通过靶向AMPK对肺癌细胞系A549能量代谢及凋亡的影响

目的探讨转染Let-7a-3p对肺癌细胞能量代谢及凋亡影响及机制。方法根据肺癌A549细胞处理不同分为A549组、Let-7a-3p组(转染Let-7a-3p mimics)、阴性对照组(negative control mimic,NC)和未转染对照(non transfected,NT)组。采用RT-qPCR法检测各组细胞Let-7a-3p的水平,CCK8法检测细胞活力,海马细胞能量代谢实时测定仪XF分析测定氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),流失细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Let--7a-3p、Bcl-2、Caspase--3、Ras及AMPK蛋白的表达。结果Let-7a-3p组Let-7a-3p表达水平明显上调(P<0.01),而NC组Let-7a-3p表达水平与A549组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CCK-8法检测结果显示,与A549及NC组比较,Let-7a-3p组活细胞相对数明显减少(P<0.01)。能量代谢实时测定仪XF分析结果显示,与A549、NC组比较,转染Let-7a-3p后A549细胞的氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)减少(P<0.01)。流失细胞术检测结果显示,与A549组比较,Let-7a-3p组细胞凋亡率增多(P<0.01)。Western blot检测结果显示,过表达Let-7a-3p可以使A549细胞中Caspase-3与AMPK蛋白上调(P<0.01),而Bcl-2与Ras蛋白下调(P<0.01)。结论Let-7a-3p模拟物可以抑制肺癌细胞A549的活性和能量代谢并促进其凋亡。Let-7a-3p模拟物作用于癌细胞的机制可能是通过上调AMPK及Caspase-3蛋白水平,下调Bcl-2与Ras蛋白水平,从而触发能量代谢和凋亡通路,降低MMP,从而抑制ATP的产生。

circPVT1通过miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1轴促进鼻咽癌细胞侵袭迁移

目的鼻咽癌是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,其临床特征之一是易发生淋巴转移,但是目前鼻咽癌转移的分子机制尚未阐明。circPVT1是由PVT1基因2号外显子反向拼接形成的环状RNA(circRNA),在多种肿瘤中表达上调,本文探讨了circPVT1在鼻咽癌侵袭迁移中的作用和分子机制。方法通过RT-qPCR检测circPVT1及其下游miRNA和FSCN1在鼻咽癌细胞的表达情况,Transwell和划痕愈合实验检测circPVT1对鼻咽癌细胞侵袭迁移的影响,RNA pull-down实验检测circPVT1结合的miRNA,双荧光素酶报告实验检测miR-24-3p和let-7a-5p靶向抑制FSCN1 mRNA表达。结果在鼻咽癌细胞中过表达circPVT1可以促进鼻咽癌细胞侵袭迁移,而敲低circPVT1则可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭迁移。进一步研究发现,circPVT1可以通过竞争性吸附miR-24-3p和let-7a-5p,上调FSCN1的表达,从而促进鼻咽癌细胞的侵袭迁移。结论circPVT1通过miR-24-3p/let-7a-5p/FSCN1轴促进鼻咽癌细胞侵袭迁移,证实circPVT1是鼻咽癌发生发展过程中一个重要驱动因子。

三种方法提取血清miRNA效果的比较

目的比较Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA的效果。方法分别选取2例健康人、2例肺炎患者和2例肺癌患者血清,以Let-7a-5p作为目标mRNA,线虫Cel-miR-39-3p作为内参,分别采用Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA,以Let-7a-5p及Cel-miR-39-3p特异性引物进行反转录PCR,以反转录PCR产物为模板运用SYBGreenⅠ法进行荧光定量PCR检测。结果 Trizol法与蛋白酶K消化+Trizol法均能有效提取到血清miRNA,而沉淀裂解法由于没有对血浆中的RNA进行富集故提取效果不佳。Trizol法提取较蛋白酶K消化+Trizol法相比,可以减少蛋白酶K的消化时间且提取效果更好,并且血清与Trizol试剂的体积比为200∶600时效果相对较好。三种方法检测Cel-miR-39-3p的Ct值基本一致。Trizol法和蛋白酶K消化+Trizol法在提取过程中加入的内参丢失较少。结论 Trizol法作为总RNA提取的手段适用于血清miRNA提取,通过调整血清与Trizol试剂的用量可使提取到的血清miRNA能够满足试验需要。