漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)养殖群体微卫星座位遗传多态性的分析

为了解漠斑牙鲆群体的遗传背景，并为漠斑牙鲆人工养殖业健康和可持续发展提供理论依据，利用筛选获得的10对微卫星引物对漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）养殖群体进行了群体遗传学分析。该群体等位基因平均数为4．0，平均杂合度为0．597 7。各多态座位的有效等位基因数则为1．7～4．1，多态座位杂合度的观察值为0．2917～O．9583，无偏倚期望值范围为0．4053～O．7553，Hardy-Weinberg遗传偏离指数为－0．4517～0．3466。每个座位上的多态信息含量为0．353-0．746，个体识别率为0．176～0．559，非父排除率为0．405～0．755，其累积个体识别率和非父排除率均达到0．9999和0．9937，这些座位均属中识别力以上的遗传标记，可以应用于今后的漠斑牙鲆的遗传育种（如雌核发育等）研究。

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LHβ基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。

漠斑牙鲆(Paralichthys Lethostigma)苗种培育试验

为探索漠斑牙鲆的苗种培育技术 ,分别于 2 0 0 3年和 2 0 0 4年从美国引进漠斑牙鲆的初孵仔鱼进行鱼苗培育试验和淡化试验。试验获得了成功。 2 0 0 3年引进初孵仔鱼 4 .0万尾 ,培育出体长 4 5cm的鱼苗 2 2 5 0尾 ,鱼苗培育成活率为 5 .6 % ,其中前期和后期的培育成活率分别为 9.0 %和 6 2 .5 %。 2 0 0 4年引进初孵仔鱼 4 .5万尾 ,经培育共获得体长 4 5cm的鱼苗 2 830尾 ,培育成活率为 6 .3% ,其中前期和后期的培育成活率分别为 11.8%和 6 3.6 %。经过逐步淡化的鱼苗在纯淡水中生长良好。

漠斑牙鲆养殖群体RAPD遗传多样性的初步分析

利用RAPD技术对由美国引进的漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）齐殖子一代群体的遗传多样性进行了研究。实验用漠斑牙鲆鱼苗于2004年10月取自山东莱州大华水产有限公司，共24尾，全长平均为16．6mm±1．99mm。活体取其肌肉，用高盐法柚提获得总DNA，琼脂糖电泳检测，Beckman DU-6100型紫外分光光度仪定量后用随机引物进行PCR扩增，从25个随机引物中筛选出11个用于群体遗传学分析，共获得77条清晰重复性高的DNA片段，大小在100～2000bp之间，多态谱带比例和群体平均杂合度分别为66．23％和0．3526。

漠斑牙鲆引进种群同工酶的遗传多态性分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳技术对引进种漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)子一代的同工酶进行检测。分析了48个样本的15种同工酶在漠斑牙鲆肌肉和肝脏两种组织或器官中的表达情况,以期为其种质资源的保护和开发以及遗传育种方面的研究提供基础资料。15种同工酶共记录了33个基因座位,其中Me-1、Adh-1、Sdh-1、Sdh-2、Gdh-1、G6 pd-1、Pgm-1、Idh-1、Cat-1、Pod-1和Pgi-1共11个座位呈多态,多态座位百分数是33.3%。平均每个座位的等位基因有效数值Ae为1.219 6,预期杂合度He为0.121 9,实际杂合度Ho为0.154 7。同时还分析了漠斑牙鲆各个多态座位的Hardy-Weinberg遗传偏离指数d。这些数据说明,漠斑牙鲆群体拥有较高的遗传变异水平,还处于种质资源维持较好的状态,有利于对其资源进行开发以及对其遗传育种工作的展开。[中国水产科学,2006,13(1):13-19]

漠斑牙鲆生物学及其养殖研究进展

漠斑牙鲆原产于美国沿海,美国自90年代初开始研究漠斑牙鲆的繁育及其养殖技术。近年来,我国从美国引进漠斑牙鲆进行培育。本文对国内外漠斑牙鲆生物学及其养殖的研究进行了总结,提出了漠斑牙鲆今后研究的方向。

光照对漠斑牙鲆仔鱼摄食、生长与存活的影响

研究了光照对漠斑牙鲆仔鱼的摄食、生长及存活的影响．结果表明，漠斑牙鲆摄食的较适宜光照度范围为10-600lx．在该光照条件下，仔鱼生长最快，存活率最高，饵料转换期最短．过强或过弱的光照均不利于仔鱼的生长发育．黑暗条件下仔鱼在27日龄时大部分因饥饿而死亡．在生产上，夜间适当延长光照时间可缩短育苗周期．

花鲈冷冻精子诱导漠斑牙鲆雌核发育

采用紫外线(UV)对冻存的花鲈精子进行照射使其遗传物质失活,作为异源精子诱导源,与漠斑牙鲆卵子进行"授精",可以诱导漠斑牙鲆卵进行雌核发育。结合静水压处理,抑制第二极体排出,成功获得了漠斑牙鲆雌核发育二倍体鱼苗。实验表明,同源精子和异源精子均可在紫外线照射遗传失活后诱导漠斑牙鲆卵雌核发育,经实验筛选出异源精子诱导漠斑牙鲆雌核发育的最佳条件为花鲈冻存精子采用80mJ/cm2的紫外线照射,然后与漠斑牙鲆卵子进行授精,培育水温18℃条件下,受精后4～5min,施以65MPa的静水压休克处理6min,可有效诱导漠斑牙鲆卵的雌核发育。采用形态学、流式细胞仪DNA含量分析和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体。本文首次报道了采用异源冷冻精子诱导漠斑牙鲆鱼卵进行雌核发育的技术方法,为漠斑牙鲆性别控制和遗传改良提供了技术手段。

漠斑牙鲆仔、稚、幼鱼的形态发育研究

2006年12月至2007年2月，在福建省漳州市东山县华涛水产综合养殖场，对漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）仔、稚、幼鱼各发育阶段的形态特征进行了观察和描述．初孵仔鱼平均全长2．73±0．211mm．在培育水温18．1—23．0℃和盐度为33—34条件下，初孵仔鱼至孵化后7日龄为前期仔鱼，6日龄仔鱼开口；孵化后8日龄至30日龄为后期仔鱼；孵化后31日龄至45日龄为稚鱼期；孵化后46日龄进入幼鱼期．冠状幼鳍的消长、右眼的移位以及体色的左右不对称是漠斑牙鲆早期发育过程中最明显的外部形态变化．

真鲷精子诱导漠斑牙鲆减数雌核发育

采用紫外线（UV）灭活的冷冻真鲷（Pagrosomus major）精子激发漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）卵子发育。冷冻真鲷精子适宜的UV灭活剂量为72 mJ/cm^2, 随着处理时间延长, 胚胎的孵化率呈现哈特维希效应, 其中40s灭活组胚胎孵化率达到最高[（29±1.9）%], 单倍体率100%。利用冷休克法抑制卵子第二极体排出, 成功获得雌核发育二倍体仔鱼。冷休克处理温度为0-2℃, 处理起始时间3min、持续时间45min时, 雌核发育二倍体胚胎的孵化率最高, 达（9.4±0.71）%, 获得批量雌核发育仔鱼。雌核发育仔鱼经流式细胞仪和染色体倍性鉴定, 均为二倍体（2n=48）, 未发现单倍体和非整倍体现象。雌核发育二倍体组和单倍体组与正常二倍体组组孵化时间差异显著, 分别历时64h59min和55h49min。雌核发育二倍体仔鱼与正常二倍体仔鱼形态特征差异不显著（P〉0.05）, 单倍体仔鱼明显畸形。研究表明, 采用适宜的紫外线剂量灭活的冷冻真鲷精子可成功诱导漠斑牙鲆雌核发育, 获得雌核发育二倍体后代, 研究结果可为漠斑牙鲆全雌化苗种生产提供技术和理论依据。

漠斑牙鲆胚胎细胞系的建立与鉴定

漠斑牙鲆（Paralichthyslethostigma）是中国近年新开发的重要海水养殖鱼类，本研究以漠斑牙鲆囊胚期胚胎为材料，探索了鱼类胚胎细胞分离和培养的条件，建立了漠斑牙鲆胚胎细胞培养技术。建立的漠斑牙鲆胚胎细胞系（SFEC）至今已经培养了240多天，传至80多代。SFEC的完全培养基采用添加抗生素、胎牛血清（FI强）、花鲈血清（sPS）、成纤维生长因子（bF（正）的DMEM。SFEC形态小而呈圆形、多边形，在培养基中生长迅速。本实验检测了温度、胎牛血清浓度、成纤维生长因子对SFEC生长的影响。在24--30℃之间SFEC生长良好，但当温度低于18℃时细胞生长速度明显减慢。在含15％FBS的培养基中，SFEC生长速度明显比在含7．5％FBS的培养基中快，在培养基中添加bFGF可以使细胞生长速度显著提高。SFEC的二倍体核型为2n=6st＋42t。将GFP报告基因通过脂质体介导的方法转入SFEC中并成功地获得了表达，转化率为20％。[中国水产科学，2007，14（4）：579—583]

漠斑牙鲆早期发育阶段的摄食与生长特性

2006年12月至2007年2月，在漳州市东山县华涛水产综合养殖场，采用生态学方法对人工培育的漠斑牙鲆仔、稚、幼鱼的摄食习性与生长特性进行了分析．结果表明，在水温为18．1～23℃时，仔鱼在孵出第6天开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫（Bruchionus plicatilis），以后随着鱼体的生长，开始投喂卤虫无节幼体．对288尾仔、稚、幼鱼观察结果表明，其摄食率达83．0％，消化道饱满系数波动在0．9％～6．6％之间，日摄食指数在6．8％～29．6％；摄食具有明显的昼夜节律，一昼夜中仔鱼出现两个摄食高峰，分别出现在12：00和翌日08：00，稚鱼摄食高峰出现在10：00～14：00，幼鱼摄食高峰出现在12：00，但12：00～20：00均保持较高的摄食水平．仔、稚鱼夜间基本不摄食，幼鱼夜间有少量摄食．摄食量（Y）与体重（W）的关系式为Y=0．0307w＋0．0505，全长（LT）与日龄（D）的关系式为LT=2．6661e^0.0433D，体重（W）与日龄（D）的关系式为W=0．065e^0.169 3D，全长（LT）与体重（W）的回归方程为W=0．0018LT^3.6894．

饥饿对漠斑牙鲆前期仔鱼生长发育的影响

研究了饥饿对漠斑牙鲆前期仔鱼生长发育的影响,并计算了仔鱼的饥饿不可逆点。结果表明,仔鱼3日龄开口,卵黄于5日龄消耗完毕,油球于6日龄消耗完毕,混合营养期为3～6日龄,饥饿对仔鱼卵黄和油球的吸收速度影响不显著。摄食仔鱼生长呈线性增加,饥饿仔鱼则在饥饿开始一段时间后呈现负增长的趋势。10日龄饥饿仔鱼出现较为明显的饥饿特征,如胸角凸出,消化道萎缩等。在18～20℃培育水温下,仔鱼饥饿不可逆点出现在7日龄和8日龄之间。

漠斑牙鲆染色体组型研究

以体长6cm左右的漠斑牙鲆幼鱼为材料,采用秋水仙素浸泡的方法,取鳃和鳍经低渗处理,空气干燥制片法制作染色体标本,最后经Giemsa染液染色进行核型分析。结果表明,漠斑牙鲆的染色体核型为2n=48,48t,染色体臂数为NF=48,未发现有多倍体的现象,也未发现性染色体和随体。

不同饵料系列对漠斑牙鲆苗种培育效果的影响

报道了不同饵料系列对漠斑牙鲆苗种成活率和生长率的影响.32.0万粒的受精卵经57 d培育,共获得全长2.7～5.5 cm的鱼苗16.6万尾.在仔鱼开口后自始至终加投配合饵料的饵料系列组（B组）的成活率比在35日龄才开始驯化配合饵料的饵料系列组（A组）的成活率高.初孵仔鱼至变态伏底时A、B组的成活率分别为58.9%和88.7%,从变态伏底始至出苗时全长平均为3.84 cm的A、B组幼鱼的成活率分别为79.0%和83.6%,从初孵仔鱼至出苗时的A、B组的总成活率分别为46.5%和72.4%,而两组的生长率差异不大.

漠斑牙鲆微咸水养殖试验

在盐度为2.0～3.0的微咸水条件下,用已淡化的漠斑牙鲆鱼种开展漠斑牙鲆工厂化养殖试验。经183d养殖,漠斑牙鲆平均体重由45g增长至313g,平均增重268g,日均增重1.46g,成活率92.9%,平均产量7.21kg/m2,投饲系数0.73。

漠斑牙鲆肌肉氨基酸和脂肪酸组成分析与营养品质评价

对人工养殖漠斑牙鲆肌肉进行一般营养组分、氨基酸和脂肪酸组成分析,并对其营养品质进行评价。结果表明:漠斑牙鲆肌肉鲜样中粗蛋白和粗脂肪含量分别为17.74%和3.02%。肌肉粗蛋白中检测出19种氨基酸,其中谷氨酸(120.4mg/g pro)、天冬氨酸(75.4mg/g pro)、甘氨酸(73.6mg/g pro)、亮氨酸(72.3mg/g pro)、赖氨酸(67.8mg/g pro)和精氨酸(63.4mg/g pro)含量较高。依据世界粮农组织/世界卫生组织/联合国大学(FAO/WHO/UNU)必需氨基酸基准模式,10种必需氨基酸评分均大于100,表明漠斑牙鲆肌肉蛋白是氨基酸平衡性较好的优质蛋白。脂肪酸检测结果显示漠斑牙鲆肌肉中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量分别为32.23%、30.79%和27.01%。n-3系列多不饱和脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA,C20:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,C22:6n-3)含量较高,为7.38%和12.07%;n-6系列多不饱和脂肪酸中花生四稀酸(AA,C20:4n-6)含量最高,为4.49%。n-6和n-3系列多不饱和脂肪酸比值为0.35,远低于我国和英国卫生部推荐的4.0最高安全限值。

影响漠斑牙鲆稚鱼的自残因子的研究

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)稚鱼阶段,自残现象比较严重。本文以漠斑牙鲆稚鱼为实验对象,选取全长10.1—40.9mm的漠斑牙鲆进行试验观察。研究了密度、浑浊度、饥饿、个体大小差异对该幼鱼自残的影响程度。(1)密度、投饲量、个体大小差异对漠斑牙鲆稚鱼的自残行为影响极显著;高密度组的比低密度组自残现象严重;饱食组的自残率较1/3饱食投饲量组别的轻;个体大小差异是引起自残最重要的因子,当投喂不充足时,(10.1±0.4)—(20.3±0.3)mm组的自残现象最为严重自残死亡率为53%。(2)饥饿对自残行为影响显著,饥饿24h后自残死亡率为20%((15.0±0.4)mm组)。(3)浑浊度、饵料种类对自残行为影响不显著,在密度为20尾/L时,无浑浊度组稚鱼自残死亡率为8%,浑浊度组5%。

饥饿和再投喂对漠斑牙鲆生化组成的影响

对漠斑牙鲆Paralichthys lethostigma分别饥饿5、10、15 d(记为S5、S10、S15组)后再恢复投喂20d,分析了饥饿和再恢复投喂后全鱼的生化组成。结果表明:饥饿结束时,S5、S10、S15组鱼的体重损失率分别为1.18%、8.36%、11.76%,其中S15组的体重和饥饿前有显著差异(P<0.05)。在饥饿状态下,S5、S10组漠斑牙鲆全鱼蛋白质含量变化不显著,S15组则显著低于对照组(P<0.05);各饥饿组脂肪含量逐渐下降,并与对照组有显著差异(P<0.05);各饥饿组水分含量升高,且S15组达到显著水平(P<0.05);各饥饿组灰分含量高于对照组水平,且S10、S15组达到显著水平(P<0.05)。再投喂过程中,S15组蛋白质含量逐渐升高,各饥饿组脂肪含量逐渐升高,水分和灰分含量逐渐下降。

漠斑牙鲆引进群体子一代遗传多样性的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对引进群体漠斑牙鲆Paralichthys lethostigma子一代48个个体的遗传多样性进行了分析,筛选的40个10bp的随机引物中,25个引物产生了稳定性好,可重复性强的谱带。共检测到154个位点,其中多态位点有122个,多态位点的比例为79.22%,有效等位基因数为1.5629±0.3631,Nei’s基因多样性指数为0.3184±0.1843,Shannon信息指数是0.4651±0.2574。结果表明,漠斑牙鲆处于较高的遗传多样性水平。