密斑刺鲀(Diodon hystrix)fshβ和lhβ基因的克隆及表达分析

密斑刺鲀(Diodon hystrix)是南海名特优鱼类,同时具备食用和中药保健价值,但目前关于密斑刺鲀生殖生理的研究较少,影响了该鱼繁育理论研究的发展。众所周知,促性腺激素(Gonadotropic hormone,GtH)是生殖调控的关键激素之一,在生殖调控轴中发挥着承上启下的作用。利用转录组分析及分子克隆技术从密斑刺鲀中克隆并鉴定出fshβ和lhβ基因的cDNA序列,通过生物信息学分析,发现密斑刺鲀fshβcDNA开放阅读框共363 bp,编码120个氨基酸;lhβcDNA开放阅读框共420 bp,编码139个氨基酸。通过序列比对和系统进化树分析,表明密斑刺鲀Fshβ和Lhβ均与鲀科类的鱼的亲缘关系较近。利用三级结构分析,发现Fshβ的三级结构相对保守,而Lhβ的三级结构差异较大。利用实时荧光定量的方法检测了密斑刺鲀fshβ和lhβ基因的组织分布情况,结果表明密斑刺鲀fshβ和lhβ在垂体的表达量最高,其次是性腺。此外,进一步检测了fshβ和lhβ基因在雌雄性腺发育过程中的表达模式,发现垂体中fshβ基因伴随性腺的发育,表达量逐渐下降,而lhβ基因的表达量呈逐渐增加模式。研究结果将为构建密斑刺鲀生殖调控网络提供研究基础。

重组GnRH主动免疫公猪的效果及对垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ基因表达的影响

目的:探讨重组GnRH六聚体-麦芽糖结合蛋白(MBP-GnRH-6)主动免疫的去势效果和对垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ mRNA的影响。方法:7头公猪在9周龄时用重组GnRH主动免疫,放免法测血清睾酮浓度,ELISA法测抗体效价,实时荧光定量PCR分析垂体中GnRH受体、FSHβ和LHβ mRNA的变化。结果:重组MBP-GnRH-6主动免疫公猪后,血清GnRH抗体效价显著上升,且降低了外周血清睾酮浓度(P<0.05),睾丸重量也明显下降((P<0.01),组织切片显示,曲细精管仅有少数退化的精原细胞。免疫组公猪垂体中FSHβ mRNA和LHβ mRNA显著下降(P<0.05),GnRH受体mRNA与阉割公猪相比差异显著(P<0.05),但是与未阉割公猪相比差异不显著(P>0.05)。结论:公猪接种重组MBP-GnRH-6能诱发免疫反应,中和内源GnRH的生物活性,降低了垂体GnRH受体、FSHβ和LHβ基因表达,且抑制睾酮的合成,从而导致性器官发育受阻。

猪LHβ亚基基因的单核苷酸多态性研究

本研究对猪LHβ亚基基因除上游调控区以外的序列进行了SSCP分析,结果发现在该基因的3个外显子和3′调控区内没有任何SNPs位点,仅在内含子1的1367位点和内含子2的1823位点发现2个多态性位点,并对这两个位点在二花脸、约克夏和长白猪3个群体中的基因频率进行了初步分析。

GnRH脉冲对体外原代培养大鼠GTH细胞中LHβ mRNA表达水平的影响

研究不同脉冲频率GnRH对GTH细胞分泌LH的影响。利用细胞体外培养技术结合荧光定量PCR技术,对体外培养的大鼠原代垂体细胞在不同脉冲频率GnRH刺激下,细胞LHβmRNA的变化进行了研究。在相同振幅条件下,高频刺激(30 min间隔)时,LHβmRNA表达水平达到高峰。结果表明,高频脉冲主要引起LH的表达,支持了GnRH脉冲频率本身就是一个调控信号的假说。

南江黄羊LHβ基因序列多态性与产羔数的相关分析

根据GenBank中公布的牛、绵羊、猪等动物LHβ基因序列设计引物，采用PCR扩增并以SphⅠ酶切分析了南江黄羊（246只）LHβ基因部分序列，比较了不同基因型的繁殖性能。检测到2个等位基因A和B构成3种基因型：AA（4．065％），AB（44．309％），BB（51．626％），不同基因型由第401位三碱基突变（G→A或C）引起。在各基因型间，南江黄羊1～5胎的初生窝重和产羔数差异不显著（P〉0．05），但从第2胎开始从型母羊的产羔数和窝重有增加的趋势。

山羊LHβ基因多态性与产羔数的相关分析

【目的】研究布尔山羊和西农萨能奶山羊LHβ基因多态性及其与产羔数的相关性。【方法】采集布尔山羊和西农萨能奶山羊的血样,针对LHβ基因5′调控区及3个外显子设计6对引物,利用PCR-SSCP技术检测LHβ基因在6个位点上的多态性,并用最小二乘法研究该基因多态性与产羔数的关系。【结果】引物P1与P5扩增片段具有多态性,引物P1扩增产物有PP、PQ和QQ 3种基因型,P5扩增产物有LL和LM 2种基因型,其余4对引物的扩增片段没有多态性。LHβ基因P1引物位点PP与QQ基因型相比,PP型在第153 bp处发生了C→A突变;引物P5位点LL与LM基因型相比,LL型在第64 bp处发生了T→C突变,2处突变均未导致氨基酸变化,为沉默突变。在引物P1位点,布尔山羊PP型个体第3,4胎产羔数均极显著高于PQ型个体(P<0.01),西农萨能奶山羊PP型个体第4,5胎产羔数均显著高于PQ型个体(P<0.05);在引物P5位点,布尔山羊LL型个体第4,5胎产羔数分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于LM型个体,西农萨能奶山羊LL型个体第5胎产羔数极显著高于LM型个体(P<0.01)。【结论】引物P1与P5扩增片段具有多态性,引物P1和P5位点可能对山羊的产羔数有影响。

促黄体素LHβ基因的单核苷酸多态性与牛精液品质的相关分析

采用PCR-SSCP技术分析了LHβ基因的5′UTR和3个外显子在西门塔尔、夏洛来等种公牛中的遗传多态性。结果在所扩增的LHβ基因的5′UTR 2个目的片段和外显子1、3中均未发现PCR-SSCP遗传多态;在第2外显子中发现PCR-SSCP多态,有2种等位基因A和B,有3种基因型AA型、AB型、BB型。对多态片段的测序分析表明:在LHβ基因第2外显子中1个碱基G突变为A。适合性卡方检验表明,该位点的不同基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡。用最小二乘法分析LHβ基因第2外显子不同基因型与西门塔尔和夏洛来精液品质的相关性,发现LHβ不同基因型对冻精畸形率和射精量有显著影响,对其他性状的影响差异不显著。结果表明,西门塔尔和夏洛来牛LHβ基因应是影响精液品质的一个主效基因或与影响精液品质的主效基因紧密连锁。

绵羊LHβ基因多态性与繁殖性能的相关性

设计6对引物,采用PCR-SSCP技术检测促黄体素β基因(LHβ)5′调控区和外显子在高繁殖力绵羊品种(湖羊)和低繁殖力绵羊品种(陶赛特、特克赛尔和哈萨克)中的单核苷酸多态性(SNPs),并探讨该基因与湖羊繁殖力的关系。结果显示,在5′调控区发现4个多态性位点(286 bp T→C、424 bp A→G、439 bp T→C、705 bp G→A),在第2外显子区发现2个多态性位点(1 042 bp C→G、1 136 bp C→T),在第3外显子区内没有任何SNPs位点。研究初步表明,湖羊LHβ基因AB型的平均产羔数比AA型多0.45只(P<0.05),GJ型的平均产羔数比GG型多1.83只(P<0.05),EE型平均产羔数比EF型多0.03只,但差异不显著(P>0.05);AB基因型初生重最小二乘均值比AA基因型多0.56 kg(P<0.05),体高最小二乘均值比AA基因型多2.12 cm(P<0.05);其他基因型的初生性状之间差异均不显著(P>0.05)。

南江黄羊LHβ基因序列测定及分析

参照GenBank中发表的奶牛、绵羊和猪LHβ基因序列设计引物,以35只南江黄羊为研究对象,利用PCR技术扩增并测定了山羊LHβ基因部分序列(GenBank登录号:AY853264),并利用GenBank中不同物种LHβ基因的部分编码区序列进行了系统发育分析。结果表明:在测定出的929bp序列中,包含LHβ基因5′侧翼区(136bp)、2个内含子全序列(分别为297bp和235bp)、第1和第2外显子全序列(分别为26bp和168bp)以及第3外显子部分序列(67bp)。除第1外显子前11bp为5′非翻译区外,其余外显子序列共编码83个氨基酸,前20个氨基酸为信号肽序列。山羊LHβ基因序列富含GC。在测定的35个个体中共检测到8个单碱基突变位点,位于外显子中的2个突变位点均为同义突变,其余6个突变位点位于5′侧翼区和内含子。系统发育分析结果与物种实际的演化顺序不完全相符,可能是由物种间LHβ基因GC含量的较大差异引起。本研究首次报道了山羊LHβ基因序列,为进一步探明山羊繁殖性能的遗传机理奠定了基础。

南江黄羊LHβ基因多态性与繁殖性能的相关性分析

以南江黄羊246个个体作为研究材料,利用GenBank中公布的牛、绵羊、猪等动物LHβ亚基基因序列设计引物,扩增并采用Sph I酶切分析山羊LHβ基因,比较不同基因型的繁殖性能。结果:检测到2个等位基因A和B构成3种基因型:AA型(4.065%),AB型(44.309%),BB型(51.626%)。序列分析显示不同基因型由第401位三碱基突变(G→A或C)引起。在各基因型间,山羊15胎的初生窝重和产羔数差异不显著(P>0.05),但从第2胎开始AA型母羊的产羔数和窝重相对较大(P>0.05)。上述结果为首次测定并分析山羊的LHβ基因序列的多态性。

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LHβ基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。

黔北麻羊LHβ基因多态性及其与产羔数的相关性分析

采用直接测序法检测LHβ基因在黔北麻羊中的单核苷酸多态性,以探讨促黄体素β亚基基因多态性与黔北麻羊产羔数的关系,以及该基因对黔北麻羊繁殖力的影响。结果表明:LHβ基因检测到2个突变位点,在外显子2第414位点发生了由C→T碱基突变,导致苏氨酸突变为甲硫氨酸;检测到AA、Aa 2种基因型。A等位基因频率为0.933 4,a等位基因频率为0.066 7,2种基因型之间产羔数差异均不显著(P>0.05)。在内含子2第718位点发生了由G→A碱基突变,检测到BB、Bb 2种基因型。B等位基因频率为0.950 0,b等位基因频率为0.0500,2种基因型之间产羔数差异均不显著(P>0.05)。

林麝FSHβ、LHβ基因多态位点与产香性能关联分析

【目的】为加快高产香林麝群体的选育,本文通过分析FSHβ和LHβ基因多态性位点与产香性能的关联性,以期从遗传水平上寻找林麝产香性能标记位点。【方法】研究利用新一代测序技术,采用DNA混池测序方法对100个林麝血液样本进行SNP扫描,重点关注2个候选基因的基因区或上下游2 kb区域;运用质谱分析,对74只林麝的20个候选SNP位点进行定位分析;再结合生产实际,利用产香数据与这些SNP位点进行关联分析。【结果】位于FSHβ的2个SNP和LHβ的1个SNP位点与林麝泌香性能高度相关(P<0.05);这3个SNP均位于基因的非编码区,提示这些突变位点可能与顺式调控作用有关。【结论】3个突变位点的发现可作为分子标记运用于林麝的人工选育,并为高产香林麝群体培育选种提供辅助依据。

家畜繁殖性状基因LHβ的研究进展

促黄体素是由脑腺垂体碱性细胞分泌的一种糖蛋白质激素,在动物(包括人类)的繁殖过程中起重要作用。本文介绍了国内外在促黄体素的结构与性质、生物学活性、LHβ基因的多态性及其与家畜繁殖性状的关系等方面的研究进展。

梅花鹿LHβ基因的克隆及序列分析

【目的】克隆梅花鹿LHβ基因CDS区并进行序列分析。【方法】采用PCR克隆测序的方法获得梅花鹿LHβ基因CDS区全序列,采用ProtParam tool等分子生物学工具对梅花鹿LHβ蛋白的分子量、等电点、二级结构、蛋白功能等进行预测,并采用MEGA 6.0软件构建进化树以确定其系统发育地位。【结果】梅花鹿LHβ基因CDS区全长462bp(GenBank序列号为KT199365),包含了ATG起始密码子和TAA终止密码子,共编码141个氨基酸,蛋白质分子量为15.17kDa,等电点为8.00。梅花鹿LHβ蛋白均位于膜外,无跨膜结构,平均疏水性(GRAVY)为0.391,蛋白功能预测显示,该蛋白最有可能为激素,这与本研究的目的基因相符。进化树分析结果表明,梅花鹿LHβ基因与山羊、绵羊和牛等反刍动物较近,其中与绵羊最近。【结论】梅花鹿LHβ基因CDS区序列与绵羊LHβ基因最近。

南江黄羊LHβ基因部分序列SphⅠ酶切分析

利用牛、绵羊等动物LHβ亚基基因序列设计引物,首次扩增并采用Sph Ⅰ酶切分析南江黄羊247个个体该基因部分序列的多态性.结果表明,采用Sph Ⅰ酶切LHβ亚基基因出现三种基因型,其中BB基因型占绝对优势(57.49%),其次为AB型(38.87%),AA型出现的比例非常小(3.64%),即南江黄羊群体中B等位基因频率76.925%远远高于A(23.075%).

LHβ亚基在罗非鱼腺中的表达及精巢中细胞定位

近年来大量研究表明鱼类促性腺激素不仅在垂体中表达和分泌,性腺局部也是产生促性腺激素的场所。为验证尼罗罗非鱼LHβ是否也在性腺中表达,本研究采用RT-PCR方法检测了LHβ亚基在罗非鱼垂体、卵巢和精巢中转录水平,同时通过免疫组化的方法观察了LHβ亚基在罗非鱼精巢中表达的细胞类型。结果发现,除垂体外,LHβ亚基在罗非鱼卵巢和精巢中均有表达,且表达于精原细胞、精母细胞和精子细胞中。本研究结果将为进一步揭示罗非鱼促性腺激素功能提供基础的理论依据,也对鱼类的人工繁育具有重要意义。

鸽LHβ基因mRNA时空性表达水平分析

(目的)研究鸽促黄体素β(luteinizing hormoneβ,LHβ)基因在公、母鸽不同生理时期不同组织和时期的表达差异,为分析鸽就巢泌乳行为中LH基因的作用机制提供科学依据。(方法)根据鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡等禽类的LH mRNA保守区序列设计引物,提取鸽不同时期的脑、肝脏和肾脏组织总RNA,通过RT-PCR方法合成cDNA第一条链,然后采用实时荧光定量PCR方法对LH基因的时空性表达差异进行检测。(结果)结果表明:公、母鸽LH mRNA表达量在脑组织中与青年期相比,就巢期和哺育第1 d的表达量均显著下调(P<0.05),哺育第10 d都极显著增加(P<0.01);在肝脏中,就巢期LH基因的表达显著高于青年期的表达量(P<0.05),哺育期显著低于青年期的表达量(P<0.05);在肾脏中,就巢期公鸽LH基因的表达有显著的上调趋势,而母鸽发生下调。(结论)通过对鸽不同生理时期三种组织LH基因mRNA表达水平的时空性检测,初步推断LH对鸽就巢行为的发生和维持起重要作用,本研究的结果将为进一步进行深入研究鸽就巢泌乳机理提供理论基础。

FSHR、LHβ基因多态性和法系长白猪繁殖性状的联合关联分析

实验旨在明确促卵泡素受体(FSHR)和黄体生成素β亚基(LHβ)基因多态性与法系长白猪繁殖性状的相关性以及基因多位点联合选育效果。选用384头法系长白猪,对其进行DNA提取、PCR扩增、基因测序,对突变位点的多态性信息与繁殖性状的关联性及多基因联合效果进行分析。结果表明:FSHR c.532 G>A位点GG和GA型个体的总产仔数表型值高于AA型个体(P<0.05),FSHRc.1166C>T位点TT型个体的总产仔数估计育种值高于CC型和CT型个体(P<0.05),LHβc.314 G>T位点GT型个体总产仔数表型值和估计育种值均高于TT型(P<0.05)和GG型(P>0.05)个体;三位点合并分析发现,GGTTGG、GATTGG型个体的总产仔数表型值高于其他组合个体(P>0.05),EBV值高于AACCGG型、AACTGG型个体(P<0.05)和其他组合个体(P>0.05);单位点分析发现,FSHR和LHβ基因多态性与法系长白猪的繁殖性状呈显著相关;多位点联合分析发现,FSHR和LHβ基因的优势组合为GATTGG、GGTTGG型,且联合选择效果优于单位点选择效果。

家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.