结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTB)lhp基因原核表达载体并进行表达。方法 :用PCR扩增MTBlhp基因 ,并克隆入pQE30质粒。测序正确后 ,再亚克隆入 pET32a(+)质粒 ,构建pQE30 CFP10和pET32a(+) CFP10重组体。 结果 :以重组体分别转化DH5α和BL2 1(DE3)菌后 ,经IPTG诱导 ,pQE30 CFP10未表达目的蛋白 ;而 pET32a(+) CFP10则表达出Mr 为 2 0 0 0 0左右重组蛋白。SDS PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中 ,表达量占全菌蛋白质的 38% ,用Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni NTA柱纯化 ,获得纯度为 93%的重组蛋白。结论 :成功地构建原核表达载体 pET32a(+) CFP10 ,并获得重组CFP10蛋白 ,为MTB重组抗原的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的 构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法 以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果 重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论 成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。