GRP78-c-Src信号通路介导周期性牵张力作用下牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制研究

目的探讨在周期性牵张力作用下葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对牙周膜成纤维细胞成骨分化的影响,并阐述其机制。方法应用FlexCell 5000细胞应力装置模拟牙齿正畸受力环境;应用流式细胞术细胞分选技术获得牙周膜成纤维细胞GRP78高表达细胞和GRP78低表达细胞;采用基因转染技术敲减GRP78、c-Src的表达以及过表达c-Src;蛋白质印迹实验检测成骨转录因子Runt相关基因2(RUNX2)、锌指结构转录因子(Osterix)以及成骨标志蛋白骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的表达;免疫共沉淀实验检测GRP78与c-Src激酶的相互作用;茜素红染色实验检测细胞矿化结节的形成。结果GRP78在牙周膜成纤维细胞呈异质性表达,流式分选实验获得GRP78高表达和GRP78低表达细胞。周期性牵张力处理后,与GRP78低表达细胞相比,GRP78高表达细胞成骨分化能力及c-Src激酶磷酸化水平均升高,差异具有统计学意义(P<0.05);GRP78与c-Src激酶存在相互作用;与对照组相比,过表达c-Src组细胞成骨分化能力升高(P<0.05),sic-Src组细胞成骨分化能力降低(P<0.05)。结论GRP78通过与c-Src激酶相互作用并上调其表达,进而促进周期性牵张力诱导的牙周膜成纤维细胞成骨分化。

脊柱外固定装置牵张下经皮椎体成形治疗后壁破损椎体骨质疏松压缩骨折

背景:对于后壁破损椎体骨质疏松压缩骨折伴椎管占位,国内外多采用开放手术或保守治疗。老龄骨质疏松患者用脊柱外固定装置轴向牵张前后纵韧带,使椎管占位后移骨块复位,同时扩大椎管,然后行经皮椎体成形术固化椎体,在临床中取得良好的治疗效果。目的:观察后壁破损椎体骨质疏松压缩骨折伴椎管占位患者前后纵韧带在脊柱外固定装置牵张下行经皮椎体成形的临床疗效。方法:选取老年后壁破损椎体骨质疏松压缩骨折伴椎管占位患者52例,年龄61-86岁,平均(78.62±5.20)岁;采用脊柱外固定联合经皮椎体成形术治疗,治疗前、治疗后1 d、治疗后3个月及末次随访(术后12个月)时,用X射线片及CT观察椎体前缘高度丢失率、后凸成角、椎管狭窄率及骨折椎体内骨水泥分布范围,同时进行目测类比评分、Oswestry功能障碍指数评估。结果与结论:52例患者随访3-12个月。X射线片示治疗前、治疗后1d、治疗后3个月、末次随访时的椎体前缘高度丢失率分别为(34.5±2.2)%,(3.5±1.3)%,(4.0±0.6)%,(4.4±1.1)%,后凸成角分别为(12.1±1.7)°,(4.0±0.8)°,(3.5±0.5)°,(4.4±0.2)°,CT示椎管狭窄率分别为(40.9±7.2)%,(10.7±2.5)%,(9.7±1.1)%,(9.8±0.7)%;骨折椎体骨水泥填充分布范围均≥75%;治疗前与治疗后1 d目测类比评分、Oswestry功能障碍指数比较差异有显著性意义(P<0.05),治疗后3个月与末次随访时目测类比评分、Oswestry功能障碍指数比较差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明,椎体前后纵韧带牵张下经皮椎体成形治疗不仅显著改善后壁破损椎体骨质疏松压缩骨折伴椎管占位复位的临床效果,还能提高椎体固化率,减轻疼痛,是一种安全有效的微创组合新技术。

牵张刺激下牙周膜细胞外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用

目的探索牵张加载下牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)外泌体对成骨细胞分化的影响,以及牵张加载下PDLCs外泌体在力相关牙周组织改建中的调控作用。方法对体外培养人PDLCs施加20%牵张应变后,提取上清中的外泌体与成骨细胞共培养,检测成骨细胞分化情况,并探索外泌体中发挥调控作用的miRNA。结果牵张加载下PDLCs分泌的外泌体可上调成骨细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、转录因子Osterix(Osx)、I型胶原蛋白(type I collagen,COL-1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP 2)等成骨相关因子表达,促进细胞成骨向分化。牵张加载下PDLCs外泌体差异表达miRNA中,miRNA-181d-5p表达量上调达107倍,将其转染成骨细胞后,成骨细胞中ALP、Osx、Col-1、Runx2、Ocn和BMP2等成骨相关因子表达亦增加。结论本研究初步揭示了牵张加载下PDLCs外泌体miR-181d-5p在调控成骨细胞分化中的作用,对于明确力相关牙周组织改建中的信号通路具有重要科学意义。

SMURF2/β-catenin轴促进张力条件下人牙周膜细胞成骨分化

目的:探究Smad泛素化调节因子2(SMURF2)在循环牵张力诱导人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化中的作用和机制。方法:对hPDLCs施加循环牵张力刺激后使用qRT-PCR检测SMURF2的表达和成骨相关基因的表达,使用western blotting检测SMURF2和经典WNT信号相关分子的表达,通过ALP染色检测hPDLCs的ALP活性,并结合成骨相关基因的表达评估hPDLCs的成骨分化。通过使用小干扰RNA沉默hPDLCs中的SMURF2基因探究SMURF2对牵张力诱导的hPDLCs成骨分化和经典WNT信号的影响。结果:循环牵张力刺激hPDLCs后SMURF2、ALP、OPN、OSX、COL-1和β-catenin表达升高,ALP活性也增强。沉默SMURF2基因后,hPDLCs的ALP活性减弱,ALP、OPN和OSX基因表达水平下降,β-catenin蛋白下降,但GSK-3β蛋白无变化。结论:SMURF2可能通过经典WNT信号通路促进循环牵张力诱导的hPDLCs成骨分化。

肩锁关节韧带功能解剖和生物力学研究

目的通过对肩锁关节周围韧带的功能解剖和生物力学研究来判断各相关韧带在维持肩锁关节稳定方面的作用,从而指导临床治疗。方法解剖新鲜成人肩锁关节标本16个,随机分为两组,A组保留肩锁韧带和喙锁韧带,B组仅保留肩锁韧带,比较两组之间承受拉力的差别。结果 A组拉力平均值为618.10N,B组拉力平均值为567.97N,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论肩锁韧带的抗拉强度明显高于喙锁韧带,说明就肩锁关节的稳定性而言肩锁韧带远较喙锁韧带安全。

寰椎横韧带的形态特点及其生物力学特性研究

目的 :研究寰椎横韧带的形态特点及其抗拉伸性能。方法 :成人寰枢椎固定标本 2 4例及新鲜寰椎横韧带标本 9例。测量横韧带中点处的厚度、宽度以及左右两端的宽度。取 2例新鲜横韧带标本行组织学片观察。 7例新鲜横韧带标本 ,通过MTS -85 8材料试验机测试其抗拉伸性能。结果 :寰椎横韧带的长度为 ( 2 0 .0± 2 .4)mm ;中点处的厚度为 ( 2 .1± 0 .5 )mm ;中点处的宽度为 ( 10 .7± 1.6)mm ;左右两端的宽度分别为 ( 6.6± 1.1)、( 6.7± 1.0 )mm ;左右两端的厚度分别为 ( 3 .8± 1.1)、( 3 .7± 1.1)mm。横韧带与枢椎齿突的关系可分为三种类型 :①横韧带将齿状突后面完全包裹 ,占 3 0 .3 % ( 10例 ) ;②横韧带包裹齿状突后面的大部 ,超过 1/ 2 ,占 5 4.5 % ( 18例 ) ;③部分覆盖齿状突的后部 ,不超过其 1/ 2 ,占 14 .5 % ( 5例 )。寰椎横韧带的齿状突面的中部可见有纵行的纤维 ,组织切片显示为较疏松的结缔组织。横韧带的最大载荷为( 60 5 .5± 89.6)N ,最大变形量为 ( 4 .3± 0 .5 )mm。结论 :( 1)本文结果与国外的相关报道比较 ,在长度上较白种人稍短 ,而与黄种人相近 ,这与人种的高矮有关。 ( 2 )寰椎横韧带与齿突接触面的中部可有条索状的疏松结缔组织存在。 ( 3 )寰椎横韧带与枢椎齿突的关系不恒定 ,

间隙连接蛋白Connexin43对力刺激下人牙周膜细胞成骨相关转录因子表达的影响

目的研究间隙连接蛋白Connexin43(Cx43)在牵张力刺激下对牙周膜成纤维细胞成骨相关转录因子表达的影响。方法对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(h PDLFs)施加变形量为5%的牵张力,在受力1、2、4、8、24 h后检测成骨相关转录因子Osterix、RUNX2及Cx43 mRNA的表达。分别采用间隙连接的阻断剂18α-GA和基因沉没Cx43的方法阻断Cx43后观察Osteix、RUNX2 mRNA表达的变化。结果对h PDLFs施加牵张力时,h PDLFs内的Cx43、Osterix和RUNX2mRNA水平随加力时间增加表达均明显增强(P均<O.05),在24 h达到最高值。分别阻断间隙连接通道和抑制间隙连接蛋白Cx43,结果显示Osterix和RUNX2 mRNA表达水平均受到明显抑制(P均<O.05)。结论力刺激下间隙连接蛋白Cx43及成骨转录因子Osterix和RUNX2在h PDLFs中的表达呈现时间依赖性增加。间隙连接蛋白Cx43可能参与了这两种成骨转录因子表达的调节。

机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的 :观察机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞 (PDLFs)增殖能力的影响。方法 :用自行研制的细胞加载系统对PDLFs施以频率为 6次 /min(每次为 5s牵拉、5s松弛 ) ,幅度 12 %的牵张力 ,于加载 2 4、48、96h后 ,通过细胞计数、流式细胞仪检测观察PDLFs增殖能力的改变情况。结果 :在不同的时间点 ,加力组及对照组的细胞数均不断增加 ,在 48h及 96h时加力组结果明显高于对照组。流式细胞仪结果显示在不同时间点加力组处于DNA合成期的细胞数明显高于对照组。结论 :在对培养的人PDLFs施加频率为 6次 /min、幅度 12 %的牵张力时 。

牵张应力对人黄韧带细胞成骨分化的影响

目的探讨牵张应力在胸椎黄韧带骨化症中的作用。方法牵张应力作用于胸椎黄韧带细胞后,通过PNPP法、Real-timePCR等实验方法,观察牵张应力对黄韧带细胞成骨分化的影响。结果牵张应力可以促进黄韧带细胞碱性磷酸酶活性增强,骨钙素的表达增高。结论牵张应力可促进胸椎黄韧带骨化症黄韧带细胞向成骨方向分化。

人体膝关节交叉韧带生物材料力学特征实验研究

目的:通过对膝关节交叉韧带进行生物材料力学的实验研究,为分析其损伤机理、防治、修复、人工材料置换等提供依据。方法:取膝关节无病变,年龄在25～35岁之间的成年男性左、右膝关节前交叉韧带(ACL)与后交叉韧带(PCL),共计24条。将ACL分为前内束(AMB)与后外束(PLB),PCL分为前外束(ALB)与后内束(PMB),并进行冰冻切片,制作标准试件后,使用上海大学力学实验中心"生物材料力学性能测试系统"完成"一维拉伸试验"与"应力松弛试验"。实验数据经统计学处理,进行:1)左、右ACL与PCL相同各部分之间比较;2)ACL各部分之间比较;3)PCL各部分之间比较;4)ACL各部分与PCL各部分之间比较。结果:1)左、右膝关节ACL、PCL各部分之间比较均没有显著性差异;2)1s应力松弛率PMB最大,其次为PLB、ALB、AMB;100s应力松弛率PMB最大,其次为PLB、AMB、ALB,比较结果均呈高度显著性差异(P<0.01);3)在被拉伸至2%时,AMB显著性大于PLB(P<0.05);在被拉伸至4%时,ALB显著性大于AMB(P<0.05);ALB高度显著性大于PLB(P<0.01);在被拉伸至6%和8%时,ALB显著性大于AMB(P<0.05);4)ACL与PCL各部分的拉伸刚度、弹性模量、破坏应力3项指标没有显著性差异(P>0.05);5)PLB与PMB破坏应变显著性大于AMB与ALB(P<0.05)。结论:1)人类膝关节ACL与PCL生物材料力学特征没有侧别差异;2)PMB与PLB的粘性较大,屈曲性较强,具有较好调整负荷的能力,是运动损伤不易发生的材料学原因之一;3)AMB在被拉伸的初始阶段对载荷反应较强,ALB随着材料的被拉伸长度的增加,对负荷的反应呈现逐渐增强的现象;4)由于ACL与PCL来源相同、组织结构相似,故其材料力学特征相同,在生理受力范围内,其抗拉伸能力差异不大。

动态牵张应变对人牙周膜细胞的细胞骨架的影响

目的研究动态牵张应变下人牙周膜细胞(HPDLCs)细胞骨架的变化。方法体外培养HPDLCs,利用动态牵张应变细胞加载装置对HPDLCs分别加载1%、10%和20%的牵张应变,每种应变分别加载7个时间段(0.5、1、2、4、6、12、24 h),应用激光共聚焦显微镜观察HPDLCs细胞骨架的形态结构;收集图像并运用Image-Pro Plus 4.5.0.29软件进行分析,测定HPDLCs的面积、长度与宽度比(长宽比)以及细胞骨架蛋白F-actin的积分荧光强度。结果激光共聚焦显微镜观察发现:随着加载牵张应变的作用时间延长和应变值提高,HPDLCs细胞逐渐呈现栅栏状相互平行排列趋势,且排列方向垂直于牵张力方向,胞体被拉长。图像分析结果显示:加载动态牵张应变后,HPDLCs的细胞面积、长宽比及F-actin的表达量均发生相应的变化。结论动态牵张应变可引起HPDLCs细胞骨架的变化,并且与施加应变的大小和应变作用时间有关。

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平的变化

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)水平的变化。方法:通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1%、10%和20%动态牵张应变加载。加载不同时间,通过流式细胞仪对细胞进行PLC-γ1水平检测。采用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:在加载牵张应变初期,细胞内的PLC-γ1水平维持较低水平;随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内的PLC-γ1水平逐渐升高。50min时,PLC-γ1水平达到各应变组的最高值(P<0.01)。随着加载时间的继续延长,60min时,各应变组的PLC-γ1水平都显著下降(P<0.01)。结论:牵张应变可引起细胞内PLC-γ1水平的变化。

前交叉韧带胫骨棘止点的形态学特征及其生物力学特性研究

目的:研究前交叉韧带及其胫骨棘止点处的形态特征及其抗拉伸性能,为前交叉韧带胫骨棘撕脱骨折的临床治疗提供解剖和生物力学依据。方法:取正常成人新鲜的膝关节标本16例,游离出前交叉韧带,对其胫骨棘止点处的厚度、宽度及其在胫骨棘止点处的分布特点等进行观察。新鲜的标本通过MTS-858材料试验机测试前交叉韧带附着端的抗拉伸性能。结果:前交叉韧带呈水平位附着于胫骨棘及其周围的骨面,其断面近似于三角形,底朝前,尖向后方。部分纤维附着于外侧半月板的前、后角及内侧半月板前方的骨面。附着端横径为(11.3±1.4)mm、前后长径为(17.6±2.6)mm、周径为(49.2±6.1)mm、前缘距胫骨平台前缘为(11.5±2.6)mm、后缘距后交叉韧带胫骨附着区的前缘为(14.1±1.7)mm、计算附着面积为(96.6±8.3)mm2。前交叉韧带的最大载荷为(2546±89)N,最大变形量为(4.3±0.5)mm。结论:前交叉韧带的纤维分布及其胫骨棘止点处的形态特征以及生物力学特性与临床上撕脱骨折的治疗有很大的关联性。

牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中caspase蛋白酶表达的初步研究

目的研究在牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中caspase蛋白酶表达的变化。方法对体外培养的人牙周膜细胞分别施加20%牵张应变6、24 h,采用流式细胞术测定细胞凋亡率,采用免疫印迹技术检测caspase-3、-5、-7、-8、-9的蛋白表达,并采用分光光度比色法测定caspase-3、-5、-8、-9的蛋白酶活性变化。结果 20%牵张应变加载6、24 h可诱导人牙周膜细胞发生凋亡。caspase-3的蛋白表达及蛋白酶活性和caspase-7的蛋白表达在24 h牵张应变作用下较对照组增加,caspase-5、-8、-9的蛋白表达及蛋白酶活性在6、24 h牵张应变作用下较对照组增加。结论 20%牵张应变能诱导体外培养的人牙周膜细胞凋亡,此过程中伴随发生了caspase-3、-5、-7、-8、-9蛋白酶的活化。

机械牵张应变对人牙周膜细胞内游离钙离子浓度的影响

目的:观察机械牵张应变作用下,人牙周膜细胞(HPDLCs)内游离Ca2+浓度的变化。方法:体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置,对1%、10%和20%应变组的细胞分别进行30、60和120min的动态牵张加载,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2+浓度的变化,并应用SPSS13.0软件包对数据进行方差分析。结果:当HPDLCs加载30min时,各组检测到的胞内游离Ca2+浓度与对照组无显著差异(P>0.05);60min时,各个应变组的胞内Ca2+浓度明显升高,与对照组相比均有非常显著的差异(P<0.01);加载时间延长到120min时,各组Ca2+浓度又降至对照组水平(P>0.05)。结论:机械牵张应变可通过钙离子信号系统影响HPDLCs的生物学活性。

牵张应变对人牙周膜细胞中NLRP3炎症体通路相关因子表达的影响

目的研究牵张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)表达炎症体通路相关因子的影响。方法对体外培养的HPDLCs施加20%牵张应变6、24 h,分别采用实时定量PCR以及免疫印迹技术检测NLRP3、Caspase-1及IL-1β的mRNA及蛋白表达的变化。对体外培养的HPDLCs施加20%牵张应变1、2、4、6 h后,采用酶联免疫吸附实验检测细胞分泌的IL-1β蛋白变化。对照组HPDLCs培养于弹性培养皿中,与动态牵张应变加载组的培养条件一致,但不加载应变。结果 6 h牵张应变作用下HPDLCs中NLRP3、caspase-1及IL-1β的mRNA及蛋白表达较对照组增加(P<0.05);24 h牵张应变作用下HPDLCs中NLRP3的蛋白表达水平上调(P<0.05);加载牵张应变4、6 h后,细胞培养上清中IL-1β含量随牵张时间的增长而增加(P<0.05)。结论20%机械牵张6 h能诱导HPDLCs中NLRP3/Caspase-1炎症体-IL-1β通路因子的表达。

周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin表达的影响

目的:研究在机械力作用下人牙周膜细胞(h PDLCs)内Periositn(PN)m RNA和蛋白的表达变化。方法:采用组织块酶消化法培养h PDLCs,经鉴定后将第4代细胞随机分为4个实验组和1个对照组(非加力组),4个实验组分别采用Flexcell-5000 Tension System应力加载系统对h PDLCs加载6、12、24、48 h的周期性张应力;然后采用q RT-PCR、Western blot分别检测各组h PDLCs中PN m RNA和蛋白的表达变化。结果:在正常h PDLCs中表达PN m RNA和蛋白;与对照组相比,加力6 h后,PN m RNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);加力12 h后,PN m RNA和蛋白的表达均逐渐升高,并持续至24 h达最高水平(P<0.05);而在加力48 h时,PN m RNA和蛋白表达均明显下降,并恢复至对照组的表达水平(P>0.05)。结论:机械力可诱导h PDLCs中PN的表达增强及活化,且具有时间依赖性;提示PN可能参与了细胞内生物力学信号的转导。

周期性张应力对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:探讨周期性张应力对体外培养的人牙周膜细胞生物活性的影响。方法:对体外培养的人牙周膜细胞施加不同大小的周期性牵张力(6%、12%、20%细胞表面拉伸率),24h后检测其对细胞的总蛋白合成、ALP活性、Col-Ⅰ和OCN分泌的影响。实验结果用SPSS 13.0进行统计分析。结果:较小的牵张力对人牙周膜细胞生物活性无显著影响,随力值的增大,牵张力能够呈强度依赖性抑制人牙周膜细胞的活性,减少总蛋白合成及ALP活性,抑制Col-Ⅰ及OCN的分泌。结论:周期性张应力可以抑制人牙周膜细胞的生物学活性,并呈强度依赖性。

机械拉伸对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响

目的 :研究拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响。方法 :应用酶联免疫吸附实验及考马斯亮蓝微板法对拉伸应变下的细胞合成代谢变化进行观察 ,应变范围为 1%～ 8%。结果 :在 0 .5 %～ 8%拉伸应变范围内 ,人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成无明显变化 ,但 1%～ 8%拉伸应变作用下细胞蛋白合成减少 ,其中2 %拉伸应变影响最明显。结论

人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。