应用SYBR GreenI的Real-time PCR方法定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viablebutnonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。本文基于LightCycler为平台,利用SYBRGreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立一种Real-timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时,发现所有空肠弯曲杆菌(11株)都呈阳性,所有其它弯曲菌(3株)和其它菌株(5株)都是阴性。整个检测过程60min内可以完成,检测限度为5CFU,标准曲线的相关系数为1。结果表明基于SYBRGreenI的定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。

福建地区汉族人群N-乙酰基转移酶基因多态性

目的 探讨福建地区汉族人群N -乙酰基转移酶 (NAT2 )基因多态性分布规律。方法 应用自动实时荧光Light-Cycler技术 ,对 16 8名福建地区汉族健康人NAT2 4个位点的基因多态性进行检测 ,并与其它人群比较。结果 NAT2多态位点各基因型频率分别为 :NAT2 4 /NAT2 4 (39.2 % ) ,NAT2 4 /NAT2 6A(2 8.0 % ) ,NAT2 6A/NAT2 7A/B(14 .3% ) ,NAT2 4 /NAT2 7A/B(10 .7% ) ,NAT2 4 /NAT2 5A(3.6 % ) ,NAT2 6A/NAT2 6A (3.0 % ) ,NAT2 7A/B/NAT2 7A/B(1.2 % )。等位基因频率分别为 :NAT2 4 (6 0 .4 % ) ,NAT2 6A(2 4 .1% ) ,NAT2 7A/B(13.7% ) ,NAT2 5A(1.8% ) ;未检测到NAT2 5A纯合变异体和NAT2 14A突变等位基因。结论 福建地区汉族人群N -乙酰基转移酶 (NAT2 )基因多态分布与日本人接近 ,与欧美人显著不同。

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的 利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法 采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果 建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论 该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 。

国产实时荧光定量核酸检测试剂测定HIV病毒载量

目的在目前进口试剂较昂贵的情况下,探讨国产实时荧光定量核酸检测试剂用于检测艾滋病病毒(HIV)病毒载量的可行性。方法2004年从全国4个省的HIV感染者/艾滋病(AIDS)患者采集110份样本,每份样本均同时使用生物梅里埃公司NASBA与深圳匹基生物公司实时荧光定量PCR两种方法测定血浆中HIV RNA含量,比较两种方法所得数据间的关系。结果HIV样本病毒载量处于3.5×103-1.0×105拷贝/ml范围时,一致性较好,存在一定线性关系;在小于103拷贝/ml范围内时,两种方法检测结果基本一致;当病毒载量处于1.0×103-3.5×103拷贝/ml范围时,两种方法检测结果偏差较大;病毒载量处于大于105拷贝/ml的范围时,虽然两种检测方法数值之间无相关性,但均显示处于105以上的较高数值范围。结论NASBA与实时荧光定量PCR两种检测方法在3.5×103-1.0×105拷贝/ml范围内有着高度的相关性,国产实时荧光定量核酸检测试剂检测结果与国际上较常用的病毒载量检测方法的结果之间的差异已经缩小,在低载量的检测敏感性还需要进一步优化。总体来说,使用国产实时荧光定量核酸检测试剂可以初略定量血浆中HIV RNA含量。

肺癌患者乙酰化代谢基因型探讨

目的探讨N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因多态性与肺癌易感性的关系。方法应用自动实时荧光Light-Cycler技术,分析138例肺癌患者和112例健康人NAT24个位点的基因多态性,比较肺癌患者与对照组间频率差异。结果肺癌组(吸烟者)NAT2慢乙酰化基因型频率与对照组比较差异有统计学意义(χ2=7.97,P<0.05),并使患肺癌的危险度提高了3.12倍(P<0.05);肺癌组(非吸烟者)NAT2慢乙酰化基因型频率与对照组比较差异无统计学意义(χ2=2.88,P>0.05)。结论携带NAT2慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肺癌的高危人群。

N-乙酰基转移酶基因多态性与帕金森病相关性研究

目的 探讨N -乙酰基转移酶 (NAT2 )基因多态性与散发性帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD)的关系。方法 应用自动实时荧光Light-Cycler技术 ,分析 88例PD患者和 112例健康人NAT2 4个位点的基因多态性 ,比较PD患者与对照组间频率差异。结果 早发PD组NAT2 6A等位基因频率与对照组比较有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,使患PD的危险度提高了 2 .0 8倍 (P <0 .0 5 ) ,NAT2 5A和NAT2 7A/B等位基因频率与对照组比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;晚发PD组NAT2 4个多态位点各等位基因频率与对照组比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;未检测到NAT2 14A等位基因。结论 NAT2 6A等位基因可能主要与早发PD的易感性相关 ,并参与了神经毒素的解毒。

N-乙酰基转移酶基因多态性与肝癌易感性的关系

目的探讨N-乙酰基转移酶(NAT2)基因多态性与肝癌易感性的关系。方法应用自动实时荧光Light-Cycler技术,分析78例肝癌患者和112例健康志愿者NAT24个位点的基因多态性,比较肝癌患者与对照组间频率差异。结果 肝癌吸烟组NAT2慢乙酰化基因型频率(37.5％)与对照吸烟组(17.9％)比较差异有显著性(X2=4.67,P<0.05),并使患肝癌的危险度提高了2.76倍;肝癌非吸烟组NAT2慢乙酰化基因型频率(26.3％)与对照非吸烟组(16.1％)比较差异无显著性(X2=1.47,P>0.05)。结论携带NAT2慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群。

不同HIV-1病毒载量定量检测方法的比较研究

目的评价不同方法检NI型艾滋病病毒（HIV-1）病毒载量的相关性及一致性，探讨国产实时荧光核酸定量检测试剂盒用于临床检测HIV-1病毒载量的可行性。方法收集61份未治疗的HIV感染者／艾滋病（AIDs）病人血浆标本及57份抗病毒治疗后的血浆标本，使用深圳匹基生物工程股份有限公司实时荧光聚合酶链反应（实时荧光PCR）试剂（深圳匹基试剂）、德国罗氏公司的Cobas TaqMan HIV-1 HPS（Cobas TaqMan）试剂，德国Bayer公司的VERSANT HIV-1 RNA3．0 assay（bDNA）试剂检测血浆病毒载量，并采用Pearson及Bland-Ahman分析法比较三种方法之间的相关性和一致性。结果当样本病毒载量处于3．0～6．5log10拷贝／ml时，三种方法两两比较的一致性较好（深圳匹基试剂和Cobas TaqMan、bDNA和深圳匹基试剂、Cobas TaqMan和bDNA之间的平均差异分别为-0．17、0．12、0．19log10拷贝／ml），存在一定相关性（R=0．428，P=0．001；R=0．351，P=0．021；R=0．795，P=0．000）；而对抗病毒治疗〉1年，病毒载量控制较好的样本，国产试剂与进口试剂检测结果的一致性仍较好，但对治疗时间〈1年的样本，国产试剂检测敏感性低于进口试剂。结论国产实时荧光RTPCR试剂检测HIV-1血浆病毒载量与进口试剂相比具有较好的相关性，并具有价格低廉的优势，建议在临床逐步推广应用。

高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体碱基组成的比较

目的 比较连续荧光检测法 (荧光法 )与高效液相色谱 (HPLC)法测定细菌染色体鸟嘌呤、胞嘧啶百分比 (GC % )的稳定性、准确性和适应性。方法 应用双股DNA结合染料 (SYBRGreen1)和能够快速升降温度的连续荧光检测仪 ,测定 9株细菌染色体的变性温度℃值 ,并根据相应的公式算出GC % ;以HPLC法直接检测细菌染色体的GC %。结果 DNA纯度对荧光法测得的GC %结果无显著影响 ,但影响HPLC的测定结果 ,荧光法 3次检测获得的 9株细菌GC %有 4株略高于文献值 ,而HPLC法测得的结果与文献值完全相符 ;用荧光法测得的标准差 ,7/ 9的菌株高于HPLC法。结论 荧光法检测细菌染色体GC %具有简便、快速且不受DNA纯度影响等优点 ,适用于临床微生物的快速诊断。HPLC法在DNA高度纯化的基础上测得的GC %准确、可靠、结果稳定 ,适于细菌分类研究 ,然而限于对标本纯度的要求及操作的复杂性 ,难以在临床推广应用。