藁本内酯衍生物对软骨细胞外基质合成与分解代谢影响

目的探究藁本内酯衍生物(LIGc)对IL-1β诱导大鼠软骨细胞外基质合成与分解代谢的影响。方法将大鼠软骨细胞分为空白对照组、IL-1β组及LIGc高剂量组(0.4μmol/mL)、中剂量组(0.2μmol/mL)、低剂量组(0.1μmol/mL)组。CCK-8法检测细胞活力;细胞免疫荧光检测COL2α1和ACAN的表达;采用RT-qPCR检测软骨细胞中SOX9、PRG4、MMP-13、ADAMTS-5的基因表达水平。Western blot检测软骨细胞中HMGB1、COX2、TLR4、NF-κB p65的蛋白表达水平。结果与正常组比较,IL-1β组软骨细胞增殖降低;COL2α1和ACAN的表达降低;SOX9、PRG4 mRNA表达下调,同时MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表达上调;HMGB1、COX2、TLR4、NF-κB p65蛋白表达升高。与IL-1β组比较,LIGc能够促进软骨细胞的增殖;增强COL2α1和ACAN的表达;上调SOX9、PRG4 mRNA表达,同时下调MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表达;下调HMGB1、COX2、TLR4、NF-κB p65蛋白表达。结论LIGc能够抑制IL-1β所致炎症因子表达,上调软骨细胞外基质合成代谢因子、下调分解代谢因子延缓软骨细胞外基质降解的作用,其机制可能与OA免疫炎症反应的TLR4/NF-κB信号通路相关。

基于HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路研究藁本内酯衍生物抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞凋亡和炎症反应的作用机制

软骨细胞是关节软骨中的独特驻留细胞类型,当其发生一系列病理改变时能够导致骨关节炎(osteoarthritis,OA)的发生。藁本内酯衍生物(ligusticum cycloprolactam,LIGc)是中药当归药效标志物藁本内酯(Z-ligustilide,LIG)的衍生物,具有抗炎、抑制细胞凋亡等多种生物学功能。然而,其对OA软骨细胞的保护作用以及潜在的作用机制尚不清楚。该研究拟进行体外实验探索LIGc抗OA保护软骨细胞作用的分子机制。采用白细胞介素-1β(IL-1β)诱导建立大鼠OA软骨细胞炎症模型,并单独使用LIGc和联合高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4/核因子-κB(HMGB1/TLR4/NF-κB)信号通路阻断剂甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)进行干预,以系统评估其治疗效果。通过cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测不同浓度下LIGc对软骨细胞活力的影响,并筛选出最佳作用浓度;Annexin V-FITC/PI凋亡染色检测各组软骨细胞凋亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组软骨细胞上清中环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素-2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测各组软骨细胞B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、HMGB1、TLR4、NF-κB p65的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组软骨细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、髓样分化因子88(MyD88)的基因表达变化。通过CCK-8确定了LIGc对软骨细胞的大致安全浓度范围,并进一步明确了LIGc作用的最佳浓度。在IL-1β的干预下,成功构建大鼠OA软骨细胞模型,且在该细胞模型中,软骨细胞凋亡率明显增加。与此同时,ELISA检测该组软骨细胞上清中COX-2、PGE2、TNF-α的表达均显著上升;Western blot检测发现模型组软骨细胞Bax、caspase-3、HMGB1、TLR4、NF-κB p65的蛋白表达显著上调,Bcl-2的蛋白表达受到明显抑制;RT-qPCR测定显示软骨细胞内HMGB1、TLR4、NF-κB p65、MyD88的基因表达经IL-1β干预后均有所提高。然而,随着LIGc的加入逆转了IL-1β诱导下上述一系列因子的表达变化。此外,LIGc联合GA共同作用下较单独添加LIGc对实验结果的逆转趋势更为明显。这些研究结果表明,从中药当归中提取并衍生的LIGc能够起到抑制软骨细胞炎症反应及减少软骨细胞凋亡的作用,且该作用的发挥可能与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路具有较强的相关性。LIGc保护软骨细胞的药理作用,对于延缓OA病情及改善患者临床症状具有潜在价值,值得进一步深入研究。

藁本内酯衍生物抑制大鼠软骨细胞凋亡和炎症的作用及机制

该研究探究藁本内酯衍生物(LIGc)对IL-1β(10 ng/mL)诱导大鼠软骨细胞凋亡和炎症的作用及机制。将大鼠软骨细胞分为Control组、IL-1β组及LIGc高、中、低剂量组。除Control组外,其余组均采用IL-1β诱导建立软骨细胞炎症模型, LIGc高、中、低剂量组分别加入0.4、0.2、0.1μmol/mL的LIGc干预24 h。CCK-8检测LIGc对大鼠软骨细胞活性的影响;Hoechst 33258染色观察大鼠软骨细胞凋亡情况;Western blot检测细胞中Bcl-2、Caspase-3、TLR4、NF-κB p65蛋白表达情况;RTq PCR检测COX-2、HMGB1 mRNA的表达水平。研究发现不同浓度LIGc对大鼠软骨细胞的存活率无显著影响;与Control组相比, IL-1β组细胞凋亡水平明显升高;Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.01), Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。COX-2、HMGB1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。LIGc干预使得细胞活力显著升高并抑制细胞凋亡, Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.01), LIGc中、高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01);COX-2、HMGB1基因表达水平均显著降低(P<0.01)。TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。因此,LIGc能够抑制IL-1β所致的软骨细胞凋亡和炎症反应,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路相关。