侵染浙江丽水亚洲百合的Potyvirus病毒分子鉴定

从浙江丽水的亚洲百合病叶中得到两病毒分离物G和X,电镜观察病组织汁液中含有大量线状病毒粒子,病叶细胞质中存在着柱状内含体.按照Potyvirus成员和百合斑驳病毒(Lilymottlevirus,LMoV)的已知基因序列设计特异性引物,经RT-PCR扩增分别得到1692nt和1469nt两个片段,包含NIb、CP和3'-URT,3'-端含poly(A).将CP基因序列与侵染百合和郁金香的10个Potyvirus分离物进行同源性比较,结果表明G、X与LMoV的同源性分别为85.9%～99.4%、86.1%～99.2%(核苷酸)和87.0%～96.7%、89.9%～97.8%(氨基酸),两分离物均为LMoV.系统进化树分析显示G和X分别处在LMoV的两个群体中,同源性较低,不表现地域相关性及寄主相关性.

百合斑驳病毒在卷丹顶端分生组织中的分布

【目的】百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)是危害重要食药用百合卷丹的主要病毒之一,每年给百合种植业造成数十亿的损失。通过原位杂交技术明确LMoV在卷丹顶端分生组织中的分布,为百合脱毒培养提供支撑。【方法】采用种植于贵州省清镇市的栽培卷丹作为试验材料,利用RT-PCR并于NCBI网站下载不同地方LMoV分离物构建进化树鉴定卷丹所携带的病毒种类,据检测结果选取LMoV为对象,基于LMoV基因组序列设计并制备RNA荧光探针,开展卷丹茎尖和根尖石蜡切片组织的RNA原位杂交,观察卷丹茎尖和根尖中LMoV的分布。【结果】RT-PCR检测表明卷丹材料侵染了LMoV,构建进化树发现本实验分离物与吉林和辽宁的LMoV分离物关系最近,原位杂交进而表明卷丹茎尖中LMoV杂交信号主要分布在顶端分生组织下方0.15-0.2 mm的组织中,靠近紧挨分生组织叶原基的初生叶基部有较弱的病毒杂交信号,靠近初生叶的成熟叶顶端中病毒荧光信号强烈,感染LMoV的卷丹分生组织中心纵切面无毒区大小为(0.4-0.6)mm×(0.15-0.2)mm;在根尖0.25 mm×0.2 mm分生组织中无杂交信号分布,在皮层细胞中信号最强烈,在根冠和根伸长区信号较弱。【结论】卷丹顶端分生组织及最接近顶端的一个叶原基[大小约(0.4-0.6)mm×0.2 mm]未发现病毒信号,可作为茎尖脱毒的起始材料。根顶端分生组织外侧根冠有较强病毒信号,不适合作为卷丹脱毒培养的外植体。

LSV和LMoV侵染对百合光合生理和抗氧化酶活性的影响

以东方百合"西伯利亚"为试验材料,研究了百合无症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV)侵染对植株光合生理和抗氧化酶活性的影响.检测结果表明:LSV侵染叶片中叶绿素a、b以及总叶绿素含量与健康叶片相比分别降低了15.8%、16.6%和11.1%;LMoV侵染叶片分别降低了24.3%、22.6%和16.5%.LSV侵染叶片中净光合速率、胞间CO2浓度和气孔导度与健康叶片相比分别降低了19.2%、13.4%和15.1%;LMoV侵染叶片分别降低了50.6%、48.2%和29.6%.LSV侵染叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性与健康对照组相比分别增加了24.6%、29.4%、16.5%和23.4%;LMoV侵染叶片分别增加了10.6%、18.2%、9.6%和19.6%.可见,百合植株光合生理和抗氧化酶活性均受到LSV和LMoV侵染的影响,危害程度LMoV高于LSV.

百合斑驳病毒靖宇分离物全基因组序列测定与进化分析

以采自吉林省白山市靖宇县的野生百合感病叶片为试材,采用小RNA深度测序法检测到1株百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV),采用分段克隆方法,对LMoV靖宇分离物(LMoV-JY)的全基因组进行测定并分析,以期对吉林省百合病毒病的检测和防控提供参考依据。结果表明:LMoV-JY基因组大小为9648个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号MT795719),该核苷酸序列在第154~9444位存在1个大的开放阅读框(ORF),编码1个多聚蛋白(分子量351.46kD)。LMoV-JY与GenBank中登录的其他LMoV分离物的全基因组核苷酸序列比较,其一致性为82.82%~97.85%,在氨基酸水平上的一致性为92.96%~98.64%,其中与百合斑驳病毒大连分离物LMoV-DL(HM222521)的一致性在该2种水平上均为最高。对比LMoV-JY外壳蛋白与其他54个分离物的氨基酸序列,发现可将LMoV分离物分为2个类群。

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657bp(CMV)、428bp(LMoV)、171bp(LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV三种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。

应用多重RT-PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

根据病毒外壳蛋白基因序列,设计了2对检测百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)的引物,对扩增条件进行优化,建立了同时检测LSV和LMoV的多重RTPCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV(876bp)、LMoV(662bp)。灵敏性测定结果表明,该双重PCR可从稀释104组织中检测出病毒,具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明,LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%,LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。

云南食用百合病毒病的发生与检测

通过田间调查、血清学技术、电镜技术、RT-PCR技术对侵染云南食用百合的主要病毒进行调查和研究,结果表明,食用百合病毒病的症状类型多为花叶,斑驳或者无症等类型。病毒种类主要是黄瓜花叶病毒(CMV),百合无症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV)。其中通过ELISA检测,CMV的检出率达到53.3%,LSV的检出率达到46.7%;通过RT-PCR检测,CMV的检出率达到60%,LSV的检出率达到50%,LMoV的检出率达到30%。

百合病毒的DNA芯片检测技术研究

根据已知的黄瓜花叶病毒,百合无症病毒、百合斑驳病毒基因核苷酸序列,设计引物和探针,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记核苷酸引物,不对称RT-PCR扩增产物与芯片上的寡核苷酸探针杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。研究制备的基因芯片能够检测侵染百合的3种重要病毒核酸的特异性荧光信号,该项技术具有特异、灵敏、快速的优点。

贝母-中国百合斑驳病毒的新宿主(英文)

贝母球茎是药用原材料.在田间,每年因未知病原菌的侵染而使其产量变化很大.首次报道采用reverse-transcriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)证实贝母(Fritillariathumbergii)是lilymottlevirus(LMoV)的寄主.本方法可用于植物病毒的流行性检测.

百合斑驳病毒浙江分离物的基因组3′端序列分析

经RT PCR扩增从浙江丽水的亚洲百合 [Liliumcvs.(AsiaticHybrids) ]获得 2个Potyvirus病毒分离物G和X的 3′ 端cDNA片段 ,序列分析表明均为百合斑驳病毒 (Lilymottlevirus,LMoV) ;将 1 2个来源于不同地区百合与郁金香上的Potyvirus分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析 ,结果表明G、X、ML6 1、1 2 2 9、2b、MD、HZ、J这 8个分离物的CP核苷酸序列同源性达 85 9%～ 1 0 0 % ,在进化树中聚集成簇 ,归为LMoV ;2b2、TM和TBV1 3个分离物同源性达 91 2 %～ 99 3% ,在进化树中也单独成簇 ,归为郁金香碎色病毒 (Tulipbreakingvirus,TBV) ;2b3与其它 1 1个分离物同源性在 74 4 %～ 79 8%之间 ,为伦布兰特郁金香碎色病毒 (Rembrandttulipbreakingvirus,ReTBV)。NIb基因序列和 3′ UTR序列分析也表明G、X、ML6 1、1 2 2 9、J、HZ这 6个分离物之间亲缘关系较近 ,属于LMoV ,而TM与它们的亲缘关系很远 ,属于TBV。LMoV分离物存在着两个群体 ,G和X分别处在第 1群体和第 2群体中 ,不表现地域相关性及寄主相关性。根据研究结果 ,将迄今世界各地侵染百合与郁金香的Potyvirus分离物归为LMoV、TBV和ReTBV3个种。

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400bp左右的LSV和LMoVCP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含2种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。

百合斑驳病毒大连分离物基因组全序列测定及其分析

根据GenBank上已登录的百合斑驳病毒(LMoV)基因组序列设计7对交叉重叠的引物,利用RT-PCR技术对铁炮百合白天堂进行检测,并经克隆测序获得百合斑驳病毒大连分离物(LMoV-DL)基因组全序列。序列分析表明:LMoV基因组由长度为9 648 bp的线状单链正义RNA组成,包括一个poly(A)尾巴,编码一个由3 096个氨基酸组成的分子量为351 kDa的多聚蛋白。同时多聚蛋白系统发育分析说明LMoV隶属于Potyvirus属一个较大的分支,在进化关系上与BYMV和ClYVV最近。

应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒

应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒 (LMoV)进行RT PCR检测。结果表明 ,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段 ,而健康组织无此扩增产物 ,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段。将感染LMoV组织总RNA以 1 0倍梯度稀释成不同浓度检测 ,特异引物检测的灵敏度为 1 0 -4 ,简并引物的灵敏度为 1 0 -3 。对特异引物的PCR产物进行克隆和测序 ,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为 90 %～ 99% ,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠。

侵染浙贝母的百合斑驳病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)CP血清,为研究侵染不同植物LMoV之间的血清学关系以及大田检测LMoV奠定基础。方法:根据Genbank报道的百合斑驳病毒CP基因序列设计引物,扩增其外壳蛋白基因并分析序列。将LMoV CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然LMoV病毒结合。结果:LMoV的CP与目前已报道的LMoV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为95%～99%,氨基酸序列同源性为98%～100%。制备的抗体对CP具有高度特异性,且能够与天然LMoV病毒离子结合。结论:本研究制备的抗血清可以作为百合斑驳病毒的检测。

三种百合线状病毒的外壳蛋白抗血清制备

设计3对表达引物分别扩增侵染了百合无症病毒(lily symptomless virus,LSV),百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)和百合X病毒(lily virus X,LVX)的外壳蛋白基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中原核表达。目的蛋白切胶后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot检测表明3种病毒抗血清分别与目的蛋白起特异性反应,但与阴性对照无反应。3种病毒间无交叉血清学反应。对田间栽种的百合样品间接ELISA检测表明,LMoV和LSV均有发生,但没有检测到LVX。

应用IC-RT-PCR方法检测水仙中百合斑驳病毒

水仙病毒严重影响水仙的品质与规模化生产，而快速检测水仙病毒可以有效防控其危害与扩散。根据已报道的百合斑驳病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物，利用免疫捕获PCR检测了水仙样品中百合斑驳病毒。PCR扩增产物回收后克隆到PMD19-T载体中测序。把克隆得到的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列提交到Genbank中。结果表明：基因登录号为JF714974，克隆的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列与国内外百合斑驳病毒同源性为90．4%～99．5％。建立了水仙中百合斑驳病毒的IC-RT-PCR的检测方法，简化了试验步骤，适合于水仙中百合斑驳病毒的快速检测。

荷兰进口百合斑驳病毒的分子检测

荷兰进口百合种球,经过隔离试种,采用RT-PCR方法对怀疑感染有百合斑驳病毒的百合植株进行病毒检测,通过对RT-PCR检测扩增到的产物进行克隆测序,分析其序列,并与其他6个已知斑驳毒株进行比较,其同源性达到99%,通过汁液摩擦接种健康植株,3～7天后表现出斑驳症状,确认荷兰进口百合种球携带有百合斑驳病毒(Lily Mottle Virus(LMoV))。

复合RT-PCR方法同步检测百合X病毒、百合无症病毒及百合斑驳病毒

建立了特异性检测百合X病毒(LVX)、百合无症病毒(LSV)及百合斑驳病毒(LMoV)的单一、双重及三重PCR体系并对各体系的灵敏度进行了研究。结果表明,单一PCR体系可检测的LVX最低浓度在1×10-7μg/mL,LSV最低浓度在1×10-8μg/mL,LMoV最低浓度在1pg/mL;双重PCR体系可明显检测的LVX、LSV最低浓度在1pg/mL,LSV、LMoV最低浓度在1ng/mL,LVX、LMoV最低浓度在1pg/mL;三重PCR体系可明显检测的LVX、LSV和LMoV的最低浓度为1ng/mL。

百合斑驳病毒CP与CI基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3′端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。

喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR检测及序列分析

根据基因库中已发表的百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)外壳蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR从喇叭水仙(Narcissus pseudonarcissus)‘Pink-charm’样品中扩增出1条大小与试验设计相符的553bp的特异性LMoV RT-PCR带。扩增产物序列分析表明:与GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核苷酸相似性在90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列ABW16938,发现它完全存在于GenBank登录的LMoV病毒外壳蛋白序列NP-945145中,确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。