果蝇心脏发育研究三十年进展

果蝇(Drosophila melanogaster)作为最早用于研究心脏发育基因调控的模式生物,已经走过三十年的历程。果蝇心脏发育过程经历了胚胎期、幼虫期和成虫期三大阶段。在胚胎早期,Tinman、Dorsocross和Pannier等基因是关键的调控因子。Tinman参与最早的心脏前体细胞分化和心脏细胞形成,而Dorsocross和Pannier则影响心脏前体细胞的定向分化和心脏管腔的形成。进入胚胎晚期和幼虫期,果蝇的心管经历进一步的发展和重塑,该过程主要受到转录因子Hand、Mef2以及Hox基因家族的调控。在成虫期,Hox基因家族和Tinman依旧发挥重要作用。虽然果蝇心脏与脊椎动物成熟心脏存在形态上的差异,但两者心脏的早期发育过程以及调控基因和信号通路都有保守性。本文综述了果蝇心脏发育基因调控研究的三十年进展以及利用果蝇模型研究人类心脏相关疾病的潜在希望。

利用RNAi技术研究果蝇心脏发育基因的功能

RNAi是近两年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。它通过导入一段与内源基因同源的双链RNA序列(dsRNA) ,使内源mRNA降解 ,从而达到阻抑基因表达的目的。目前已在线虫、果蝇、臭虫、真菌及植物等生物中建立RNAi技术 ,用于研究某些特定基因或已知基因在特定发育时期的功能。对于难于获得突变体的基因或生物体 ,RNAi技术尤其有效。虽然果蝇心脏发育基因wingless和tinman在果蝇心脏发育的早期功能已经清楚 ,它们都与果蝇心脏前体细胞的形成有关 ,但它们在果蝇心脏发育的后期功能仍有待进一步研究。实验运用RNAi技术 ,分别将tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎 ,得到了这两个基因的dsRNA干扰表型 ,与两个基因的突变体表型非常相似 ,都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失。尤其是tinman基因的dsRNA ,还引起了肠中胚层缺失和体壁肌肉组织的紊乱 ,而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成 ,而不影响肠中胚层 ,说明dsRNA干扰具有非常强的特异性 ,因而不失为研究果蝇心脏发育基因功能的有效方法。

脊椎动物心脏形态发育的转录调控

转录因子以组织特异性和数量的方式调节基因的表达,是胚胎发育中的主要调节因子.目前已经鉴定了一些特异性调节心脏基因的转录因子,最近又发现显性遗传转录因子的突变能引起人类先天性心脏缺陷,将心脏发育转录因子的研究直接与医学联系起来.尽管这方面的研究已经很广泛了,但心脏发育的转录调控仍不很清楚.本文对心脏转录因子及其作用研究的最新进展进行了综述.

应用三元递减法筛选特异性心脏生长相关基因

心脏是由胚胎干细胞特异性分化而来的 ,但其分化的分子生物学机制尚不十分了解 .为建立一种新的筛选特异性心脏相关基因的方法 ,克隆特异性心脏生长相关基因 .从胚胎心、成年心和去胎心的胚胎中提取 m RNA,建立胎心 /成年心和胎心 /胎身两个递减性 c DNA文库 ,通过 DNA芯片和微阵列杂交筛选和克隆 ,建立了三元递减克隆的新方法 .获得了一个全长为 1 0 0 6 bp可编码1 94个氨基酸的新的与心脏生长相关的基因 ,它是 LIM家族的新成员 ,可特异性在心肌细胞表达 ,并可促进心肌细胞的生长 .结果表明 ,三元递减筛选法可以应用于寻找新的组织特异性表达的基因 .并且获得了一个新的与心脏生长相关的新基因 。

Yippee转基因果蝇品系的建立及基因功能的初步研究

Yippee基因家族在真核生物中编码高度保守的锌指结合蛋白,其功能未知.利用RT-PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction)的方法扩增出果蝇Yippee基因CDS(coding sequence),并构建了pUAS-Yippee-IRES-GFP绿色荧光过表达质粒.通过果蝇胚胎显微注射和mini-white标记基因筛选,获得了Yippee转基因果蝇品系.将该转基因品系与Hand-GAL4杂交、Yippee基因干扰品系(39898)与Hand-GFP品系杂交,在荧光显微镜下观察杂交后代幼虫的心管和淋巴腺,结果未发现心管和淋巴腺有畸形变化.果蝇Yippee基因是否与果蝇心管和淋巴腺的发育有关尚有待深入研究.

大鼠胚胎心脏的发育过程及基因HCY-2在大鼠胚胎心脏内的表达

目的 研究大鼠胚胎心脏的发育过程和同型半胱氨酸诱导基因 (HCY 2 )在大鼠胚胎心脏上的表达 ,为进一步探讨该基因与心血管疾病之间的关系奠定形态学基础。方法 分别于大鼠妊娠 11～ 19d取胚胎 ,用组织学和免疫组织化学方法 ,观察大鼠胚胎心脏的发育过程和Hcy 2基因的表达并进行图像分析。结果 大鼠胚胎心脏 11d出现第一房间隔 ,13d出现第二房间隔 ,14d心房不完全分隔完成 ;12d出现室间隔肌部 ,16d心室已分隔完成。Hcy 2在大鼠胚胎心脏不同发育时期表达不同 ,11、12d表达强 ,13d表达减弱 ,14、15、16d表达又逐渐增强 ,17、18、19d表达强。结论 大鼠胚胎心脏内部分隔晚于小鼠 ;基因Hcy

心脏特异转录因子NKX2-5、TBX5、GATA4与先天性心脏病的研究进展

许多基因严格遵循时空顺序的表达调控着心脏的正常发育,其中任何一个基因的异常都可能导致先天性心脏病的发生。NKX2-5、TBX5、GATA4是心脏早期发育中最重要的3个转录因子,三者质或量的异常均会导致心脏畸形。大量研究提示,三者存在着复杂的相互作用,且位于许多基因的上游,可能以复合体的形式调控着心脏中许多转录因子的正确表达。本文对其特点、功能及可能的作用机制作一综述。

乙醇及其代谢产物对心肌祖细胞的毒性及H3K9表突变作用

目的探讨乙醇及其代谢产物对心肌祖细胞的毒性作用及H3K9表突变作用。方法以心肌祖细胞株为研究对象,分别用不同剂量乙醇(200、100、50mmol/L)、乙醛(16、12、8、4mmol/L)和乙酸(16、12、8、4mmol/L)处理。应用MTT实验筛选出乙醇及其代谢产物的干预浓度,Westernblot检测组蛋白H3K9乙酰化作用,实时定量PCR检测心脏发育相关基因GATA4、Mef2c、Tbx5mRNA表达量的变化。结果 MTT结果显示低浓度组50mmol/L乙醇、4mmol/L乙醛、4mmol/L乙酸的细胞活力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),不影响心肌祖细胞增殖;高浓度组200mmol/L乙醇、12mmol/L乙醛、16mmol/L乙酸对心肌祖细胞抑制率分别为31.5%、36.0%、32.1%,抑制细胞增殖(P<0.05)。低浓度组乙醇、乙酸分别使组蛋白H3K9乙酰化水平升高2.4、2.2倍(P<0.05)。心脏发育相关基因表达无明显变化(P>0.05);高浓度组乙醇、乙酸分别使组蛋白H3K9乙酰化水平升高5.3、5.6倍,同时心脏发育相关基因GATA4、Mef2c表达均增加,与对照组及相应低浓度组比较均有统计学差异(P<0.05);乙醛则无论低浓度还是高浓度对组蛋白H3K9乙酰化水平及基因表达均无明显影响(P>0.05)。结论高浓度的乙醇及其代谢产物对心肌祖细胞均有毒性作用,而乙醇及乙酸具有组蛋白H3K9表突变作用,可能为酒精致先心病发病机制之一。

P转位子诱变的果蝇心脏发育基因的突变(Ⅱ)──第3染色体基因突变

本文报道了利用Ｐ转位子诱变果蝇心脏发育基因第３染色体的基因突变的部分结果．利用Ｐ转位子诱变，共建立了２５９个第３染色体隐性致死基因平衡系，其中２６个品系表现有心脏突变表型，２个品系同时具有Ｐ转位子在心脏组织的特异ＬａｃＺ表达，表明这２个品系的Ｐ转位子可能插入到与心脏发育有关的基因中或这些基因的附近，因此。

人类心脏发育候选基因ZNF569的生物信息学分析

目的分析人类心脏发育候选基因ZNF569的生物信息学,对其功能研究提供指导意见。方法利用生物信息学网站及生物软件对人类心脏发育候选基因ZNF569进行生物信息学分析。结果ZNF569是一个新的人类KRAB/C2H2型锌指蛋白基因。此基因在基因组DNA上长约56.28 kb,定位于19q13.12。开放阅读框全长2061个碱基,含6个外显子,5个内含子,编码一个长686个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白包含一个KRAB结构域和18个锌指结构域,进化分析表明各种真核生物中都存在ZNF569的同源蛋白,而ZNF569蛋白与鼠ZNF74蛋白的相似度达到94%,它们之间的蛋白质序列保守度更高。ZNF569本身18个锌指结构蛋白质序列也高度保守。结论ZNF569及其同源蛋白构成了一个在进化中高度保守的新的KRAB-ZF基因,而它的功能尚未见报道。

HCK基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的表达

目的检测HCK基因在大鼠胚胎心脏过程中的mRNA表达变化,分析其与心脏发育的关系。方法取大鼠胚胎d12、d15、d19心脏,采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测心脏组织中HCK基因mRNA的表达丰度,并应用原位杂交的方法对其进行定位分析。结果在胚胎d12、d15、d19心脏中,HCK基因均有表达,但主要表达于心脏间质,在心肌细胞中不表达,其表达丰度分别为(0.19±0.09),(0.38±0.07),(0.59±0.10),随胚龄的增长有上调趋势(P<0.05)。结论HCK基因表达于心脏间质,在心肌细胞中不表达,并随大鼠胚胎心脏的生长发育呈动态表达,HCK可能与心脏发育相关。

Cx43基因敲除胎鼠心脏近端流出道隔心肌化过程中的关键基因

目的研究Cx43基因纯合敲除(Cx43-/-)小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的关键基因。方法以胎龄(embryonic day,ED)14.5的Cx43-/-和野生型(Cx43+/+)鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA,并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化,再与Affymetrix-430 2.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果与Cx43+/+组相比,Cx43-/-组中表达上调2倍以上的基因共有143个,表达下调2倍以上的基因有235个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期、细胞黏附、细胞活动和细胞骨架的信号通路等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,与圆锥动脉干畸形相关的TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因在Cx43-/-组有明显变化。对这些基因进行荧光定量PCR验证,结果与基因芯片一致(P<0.05)。结论利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43-/-鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,并经荧光定量PCR验证。其中TGFβ/BMP信号通路上的多个基因以及Ssr1、Ptk2、Bmp6等基因可能与Cx43-/-小鼠流出道梗阻的发生有关。

转基因技术在果蝇及脊椎动物心脏基因研究中的应用

转基因技术是一项非常重要的生物工程新技术 ,主要应用于生产药物蛋白及异种器官移植 ,建立疾病基因模型 ,提高和改善家畜生产的产量和质量以及研究新基因的功能及表达调控 .重点综述了几个新的转基因技术—UAS -Gal4系统 ,热休克启动子载体 ,RNAi技术 。

影响果蝇心脏发育的基因突变

最近的研究表明，果蝇与脊椎动物及人的心脏早期发育具有极为相似的基因控制机理，果蝇已成为研究人体心脏早期发育基因控制的理想模式动物。利用化学诱变剂甲磷酸乙酯大规模地诱变影响果蝇心脏发育的基因，利用心脏特异性抗体染色进行筛选，获得了１１２个有心脏突变表型的致死系，其中３２个致死系的心脏畸变表型有别于目前已知心脏发育基因的突变表型。细胞遗传学定位研究表明在多线染色体的１３个带纹区内的某些隐性致死突变基因是目前未知的，其功能可能与心脏发育有关的基因。

筛选控制果蝇心脏发育的基因

果蝇的早期心脏发育模式与脊椎动物的早期心脏发育模式具有惊人的相似性 ,研究果蝇心脏发育基因有助于揭示人体心脏发育机理和先天性心脏病发生机制。为了克隆和鉴定控制心脏发育的新基因 ,在化学诱变建立果蝇平衡致死系的基础上 ,用果蝇心脏组织特异抗体MabNo.3,对 310个平衡致死系进行免疫化学方法筛选 ,观察到有 6 3个致死系表现出心脏突变表型。分别将这些有心脏表型突变的品系与果蝇第 2和第 3染色体缺失系杂交 ,测定了 14个品系的遗传学位点 ,其中 7个品系在遗传学位点上有别于已报道的心脏发育控制基因。

Cx43基因敲除鼠胚心脏近端流出道组织中Galpha13信号通路基因的差异表达

目的研究Cx43基因剔除(Cx43KO)小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43KO小鼠流出道梗阻的相关基因。方法以胎龄(embryonic day,ED)14.5天的Cx43KO和野生型(Cx43WT)鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix-4302.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果与Cx43WT组相比,Cx43KO组中表达上调2倍以上的基因共有287个,表达下调2倍以上的基因有199个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,Galpha13信号通路上的多个基因在Cx43KO组有明显变化。结论利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43KO鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,其中Galpha13信号通路上的相关基因可能与Cx43KO小鼠流出道梗阻的发生有关。

T-box基因与脊椎动物心脏发育

T-box基因家族在脊椎动物心脏发育中起重要作用，主要作用于脊椎动物的早期心脏谱系决定、心室特化、房室分隔和胚胎传导系统分化等。该基因家族主要包括Tbxl、Tbx2、Tbx3、乃巧、Tbx18和Tbx20。这些基因在心脏发育过程中表现出复杂的时间、空间调节作用。本文从分子水平上对T-box基因在心脏的发生发展过程中所起的作用作一综述。

基因突变在先天性房间隔缺损和室间隔缺损发育形成中的作用研究

对于先天性房间隔缺损、室间隔缺损通过外科和介入手术治疗可大大提高患者生存率,但对其发育畸形的根本原因仍属于探索阶段。目前现有的研究表明,先天性心脏病是由于控制人体心脏发育的基因在时间(发育阶段)和空间(组织特异性)上的表达调控失误而引起的。现即从现有的基因水平研究对基因突变在先天性房间隔缺损和室间隔缺损发育形成中的作用研究作一综述,为从基因方面早期筛检、诊断、治疗先天性房间隔缺损、室间隔缺损提供参考。

应用基因芯片技术探讨小鼠胚胎心脏发育过程中的差异表达基因

目的 脊椎动物心脏发育基因表达谱远未明确 ,为此利用基因芯片技术研究小鼠心脏发育过程中的基因表达变化。方法 分别提取第 10 d～ 11d龄和 18d龄的小鼠胚胎心脏m RNA,通过逆转录反应分别标记成两种荧光 c DNA探针 ,然后与载有一组靶基因的基因表达谱芯片杂交 ,研究心脏在不同发育时期的基因表达差异。结果 在 84 0 4个靶基因中 ,14 3个基因差异表达 ,其中上调基因 5 2个 ,下调基因 91个 ;分别是细胞分裂、凋亡、信号传递、基因和蛋白质表达调控、组织细胞结构、物质和能量代谢相关的基因以及某些功能尚不清楚的基因。其中一些基因可能是心脏发育的控制基因。

TBX1基因启动子活性的初步研究

目的研究心脏发育关键转录因子T-box家族成员TBX1基因启动子的活性并确定关键区域。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TBX1基因转录起始位点上游启动子不同长度片段,酶切连接至pGL3-Basic报告基因载体,构建含不同长度TBX1基因启动子调控荧光素酶的报告基因。利用FuGene HD转染试剂将不同长度的TBX1基因启动子调控荧光素酶的报告基因载体瞬时转染293T、COS7细胞,42 h后经荧光素酶检测,比较不同长度TBX1基因启动子的活性。结果不同长度TBX1基因启动子活性不同,其中5 kb和1.2 kb的TBX1基因启动子活性较高;TBX1基因启动子在不同细胞中表现的活性不同,COS7细胞中5 kb的基因启动子活性最高,297T细胞中1.2 kb的基因启动子活性最高。结论 TBX1启动子在转录水平上可以驱动报告基因表达,不同长度启动子的活性不同,推测转录起始位点上游1.2 kb区域是TBX1基因启动子关键区域。