迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法的建立及初步应用

为构建一种灵敏、特异、准确的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)检测方法,以gyr B为靶基因设计特异性引物和探针,经过优化反应体系和退火温度,建立了迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法。随后对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估,并应用该方法进行临床样品检测。结果显示:当引物和探针浓度分别为250和200 nmol/L,退火温度为55℃时,建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法荧光曲线标准,线性关系良好,最低检测限可达12.4 CFU/m L,且1 CFU/m L的细菌经35℃培养1 h后即可被检出;与猪链球菌2型以及无乳链球菌等14种常见水生动物病原体无交叉反应;重复性试验变异系数均小于0.95%;在100份临床样品中,检出阳性22份,与细菌分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为迟缓爱德华氏菌病的临床诊断和研究提供了技术支撑。

实时PCR定量分析体内基因转染效率的可行性

为了探索实时PCR技术评价基因转染效率的可行性 ,利用克隆PCR检测逆转录病毒载体介导的neo基因导入原代成肌细胞的转染效率 ,同时行实时PCR检测 ,对二者结果进行对比分析 ;利用线性扩增介导的PCR(LAM PCR)技术和逆转录病毒 5′LTR插入细胞基因组位点的分析 ,确定单细胞内基因转染的拷贝数。结果显示 :①在低转染率的情况下 (<36 % )二者的结果相近 ,但是在高转染率情况下二者的结果差别明显 ;②逆转录病毒载体介导的转染 ,在原代成肌细胞中为单拷贝基因导入基因组内。结论 :实时PCR可以比较精确地估计体内病毒载体介导的基因转染效率 ;而在体外由于多为高转染率 。

罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立

建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒反转录微滴式数字PCR (RT-ddPCR)检测方法,可为罗非鱼湖病毒的定量检测提供技术支持。参照NCBI中GenBank登陆的TiLV第3段全基因序列,选择hypothetical protein gene基因作为靶位基因设计合成了1对引物和探针,以TiLV-cDNA为模板,摸索、优化反应方法,建立与实时荧光RTPCR检测方法的线性关系,分析方法的敏感性、特异性、重复性,最后进行临床样品检测。结果显示,当引物、探针浓度分别为500、300 nmol·L^(-1)且退火温度为54.2℃时,建立的TiLV RT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高;敏感性强,检测限低至2拷贝·μL^(-1),且在1~90 000拷贝·μL^(-1)范围内与实时荧光RT-PCR检测的线性关系较好(R2=0.995 8);检测变异系数低(4.86%);与其他5种常见的水生动物疫病病毒[鲤浮肿病毒(Carp edema virus, CEV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、草鱼出血病毒(Grass carp reovirus, GCRV)、鲫造血器官坏死病毒(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)、细胞肿大虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)]阳性样品未发生交叉反应;在临床样品的检测中,48份罗非鱼样品结果均为阴性,5份能力验证样品中3份为阳性,与能力验证满意结果一致。

PCR和LM-BP神经网络在孔隙度预测中的应用

储层孔隙度是反映储层储集性能的重要参数。目前通常选取与岩心分析孔隙度相关性较高的测井数据与孔隙度建立多元线性回归模型预测储层的孔隙度。因忽略了相关性较低的测井数据可能会造成地层孔隙度部分信息漏失,并且由于变量间的多重共线性会导致采用测井数据进行多变量综合分析时的回归模型不稳定,增大预测误差。针对以上问题,综合选取反映地层声、电、放属性的测井数据,采用主成分回归(PCR)算法、Levenberg-Marquardt(LM)算法优化的BP神经网络以及多元线性回归的方法,分别对靶区Q4段的孔隙度进行预测,结果表明LM-BP神经网络、PCR及多元线性回归的相对误差分别为7.10%、10.63%、14.99%。

PCR仪温度场热模型的研究与验证

为衡量聚合酶链反应(PCR)仪能否实现基因扩增的目的,基于传热学原理,建立PCR仪热循环系统的温度场热模型.通过有限元仿真方法对PCR仪96孔样品块温度场进行了定量描述,并绘制出单个样品孔和反应试剂的温度变化曲线.在此温度变化曲线的基础上,得到反应试剂温度与样品孔温度的关系曲线,由样品孔温度计算得出同一时刻的反应试剂温度.通过高精度温度检测系统,对PCR仪样品孔与反应试剂热循环过程中的温度进行了测量实验,所得到的样品孔与反应试剂的实际温度曲线证明了该仿真热模型的合理性.该模型为PCR仪热循环系统的热性能分析提供了理论基础和实验依据.

肉牛生长激素基因Hae Ⅲ座位多态性与主要生产性能的相关研究

本研究利用PCR RFLPs标记技术 ,对 6 3头杂种肉牛的生长激素基因的第 5外显子和 3’端区域进行了分析研究 ,发现HaeⅢ酶切座位具有多态性 ,并分为三种基因型 (即AA、BB和AB型 ) ,通过构建最小二乘线性模型 ,分析了生长激素基因型与杂种肉牛 12月龄体重和 6 - 12月龄日增重的关系。结果表明 :生长激素AB基因型的效应稍高于AA、BB型 。

显微切割结合RNA线性扩增技术的应用

背景与目的:当对无间质细胞混杂的肿瘤细胞进行选择性分析时,显微切割技术是不可缺少的,然而,从显微切割所得的细胞中获取足够RNA量相当困难。本文的目的是寻找一特异方法,将鼻咽癌细胞从肿瘤间质细胞中分离出来,并对其扩增,以备进一步研究。方法:采用显微切割技术从鼻咽癌组织冰冻切片中获取鼻咽癌细胞,提取RNA并对微量RNA进行体外转录,然后,用RT-PCR分别验证扩增RNA的β-actin和GADPH基因表达水平。结果:从鼻咽癌组织中获取了20000～40000个细胞,抽提RNA,扩增后获得了片断大小为0.5～2.5kb的RNA,在β-actin、GADPH表达完整。结论:显微切割结合RNA线性扩增技术能成功地获取较为单一的鼻咽癌细胞,扩增后的RNA完整性较好,能运用于进一步研究中。

毛细管无胶筛分电泳

围绕着毛细管无胶筛分电泳的介质和机理，概括介绍了近年来这种技术在各个方面的发展，及其在ＤＮＡ片段的分离、ＰＣＲ扩增产物的检测和蛋白质分子量的测定等方面的应用前景．

煤质的近红外光谱定量分析研究

实验中首先采用多元散射校正(MSC)的方法对煤粉样品的漫反射光谱进行了预处理,然后分别通过偏最小二乘法(PLS)和主成分分析(PCR)的方法建立煤粉样品的近红外光谱的全水分、挥发分和灰分的定量分析模型,通过预测集对建立的模型进行验证,发现利用偏最小二乘法建立的煤粉全水分模型最优,r=0.975,RMSEC=0.166,RMSEP=0.169,RPD=3.22,通过主成分分析方法建立的挥发分和灰分的模型最优,最后通过选取验证集样本对建立的模型进行了验证,得出利用近红外光谱分析技术间接对煤质进行定量分析是可行的。

牛POU1F1-exon2多态性与部分线性和乳用性状相关研究

利用PCR-SSCP技术,研究弗莱维赫牛和蒙贝利亚牛POU1F1-exon2多态性,分析其对部分线性评分性状和乳用性状之间的影响.结果表明,POU1F1-exon2存在两个等位基因——C和T.在该位点上基因频率分别为0.8426/0.1574,0.9032/0.0968.并且这两个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05.)TT基因型体重和体高的均值高于CT和CC基因型均值(P<0.05),而CT基因型均值高于CC基因型均值(P<0.05.)CC和CT基因型腹围均值显著高于TT基因型均值(P<0.05.)TT基因型强壮度和乳用性均值均显著高于CT基因型均值和CC基因型均值(P<0.05.)TT、CT基因型的产奶量均值显著高于CC基因型均值(P<0.05.)

皮埃蒙特杂种肉牛生长激素基因型与体重、日增重的相关性研究

本研究利用 PCR- RFLPs标记技术 ,对 63头杂种肉牛的生长激素基因的第 5外显子和 3’端区域进行了分析研究 ,发现 Hae 酶切位点具有多态性 ,并分为三种基因型( AA、BB和 AB)。通过构建最小二乘线性模型 ,分析了生长激素基因型与杂种肉牛高于1 2月龄体重和 6～ 1 2月龄日增重的关系。结果表明 :生长激素 AB基因型的效应稍高于AA、BB型 。

两种分子检测技术对结核分枝杆菌临床分离株耐药性诊断价值的评价

目的评价荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针技术检测结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药性突变的应用价值。方法回顾性分析2013年12月-2014年3月广州市胸科医院荧光PCR探针熔解曲线及线性探针检测142例结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药突变情况,以表型药敏试验结果为标准,评价上述两种分子检测技术的检验效能。结果142份结核分枝杆菌临床分离株中,以表型药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为92.86%、96.49%和95.77%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为72.09%、100.00%和91.55%。以表型药敏试验结果为标准,线性探针法检测142份结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为82.14%、98.25%和95.07%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为67.44%、100.00%和90.14%。荧光PCR熔解曲线法和线性探针方法对利福平和异烟肼耐药性的检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光PCR熔解曲线法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.87,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.72。线性探针法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.84,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.67。结论荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针方法在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性方面,具有同等的检验效能,可以早期快速诊断耐药结核病。

乘积合并接收的差分跳频通信系统在瑞利衰落信道上抗部分频带干扰的性能分析

该文介绍了一种新型短波跳频通信技术——差分跳频,频率转移函数设计和信号的检测方法是差分跳频中的关键技术。在瑞利衰落信道上,在有部分频带干扰和加性高斯白噪声共存的条件下,采用乘积合并接收的方法,对差分跳频通信系统的误符号性能进行了理论分析,同时做出相应的计算机仿真。结果证实了,在瑞利衰落信道上差分跳频通信系统采用乘积合并接收的方法要比采用线性合并接收的方法具备更好的抗部分频带干扰的性能。

基于LF-NMR弛豫特性的煎炸油总极性化合物含量定量建模方法

将低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)分析技术应用于煎炸油脂总极性化合物(total polar compounds,TPC)含量的预测。采用柱层析方法测定油脂样品的TPC含量作为测定值,采集油脂样品的LF-NMR弛豫特性(峰起始时间T21、T22、T23相应的峰面积比例S21、S22、S23、单组分弛豫时间T2W),分别利用向后筛选多元回归分析、主成分回归分析和偏最小二乘回归分析建立LF-NMR弛豫特性与TPC含量的回归方程,比较3种模型的校正集和预测集的决定系数与均方根误差,最终确定最优模型为偏最小二乘回归模型。应用此模型预测预测集样品TPC含量,决定系数R2可达0.928,预测集均方根误差为0.568%,模型稳定。

数字PCR检测HIV-1完整前病毒DNA方法的建立

目的通过数字PCR建立检测HIV-1完整前病毒DNA方法。方法通过培养8E5细胞(含有单拷贝整合HIV-1前病毒的T淋巴细胞系),提取DNA。通过连续稀释DNA,利用数字PCR扩增1倍、5倍、25倍、625倍、3125倍和15625倍稀释的HIV-1Ψ区、env区和真核细胞10号染色体RPP30区,计算线性关系及最低检测浓度。在数字PCR体系中分别加入5μl、3.1μl、2.5μl的DNA,各进行2批次检测,每批次重复检测4次,判断其批内变异系数,同核酸量和不同核酸量的批间变异系数判断稳定性。利用8E5 DNA检测细胞中完整前病毒含量。结果DNA在6个稀释度下,Ψ区、env区和RPP30区线性拟合优度分别是R^(2)≥0.999、R^(2)≥0.993、R^(2)≥0.996。当稀释到3125倍时,Ψ区、env区和RPP30区最低阳性液滴检出3个、2个和2个,检出浓度是2.37拷贝/μl、1.21拷贝/μl和1.58拷贝/μl。DNA的数字PCR重复性实验检测,Ψ区批内变异系数从0.66%到3.43%,同核酸量的批间变异系数分别是3.19%、4.3%和3.45%,不同核酸量的批间变异系数仅4.35%。env区批内变异系数从0.7%到3.2%,同核酸量的批间变异系数分别是3.18%、4.52%和3.4%,不同核酸量的批间变异系数仅4.02%。RPP30区批内变异系数从0.91%到2.91%,同核酸量的批间变异系数分别是3%、4.55%和3.37%,不同核酸量的批间变异系数仅在3.98%。8E5细胞中含缺陷前病毒的比例和含完整前病毒的比例分别是90%和45%。结论利用数字PCR能够检测HIV-1完整前病毒DNA,表现出较强的稳定性,为HIV-1感染者储存库检测提供技术手段。

电子鼻定量检测淡水鱼新鲜度的方法研究

挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)值是定量评价淡水鱼新鲜度的重要指标之一,为了寻求更加准确检测TVB-N值的有效方法,自行设计了电子鼻系统。该系统由金属氧化物感器阵列、数据采集卡、信号调理电路以及数据采集与处理程序构成。以鲢鱼为研究对象,利用电子鼻系统对其新鲜度进行检测。以传感器阵列响应值作为自变量,以鱼肉TVB-N值作为因变量,分别采用多元线性回归(multiple linear regression,MLR)、主成分回归(principal component regression,PCR)和反向传播神经网络(back propagation neural network,BPNN)建立了TVB-N值的预测模型。通过测试样本对3种模型进行验证,MLR预测模型对TVB-N的预测值与测量值之间的相关系数R、预测标准误差SEP、最大误差百分比RE-max及平均误差百分比RE-mean分别为0.65、5.11、7.45%和5.04%;PCR预测模型分别为0.80、2.77、5.64%和3.15%;BPNN预测模型分别为0.97、1.56、3.51%和2.18%。结果表明:BPNN预测模型性能最优,PCR预测模型性能次之,MLR预测模型性能最差。该研究为定量化检测淡水鱼新鲜度的检测提供了一种有效的方法。

利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体

目的:建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果:PCR扩增3个末端重叠的DNA片段,即1CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段;2抗体Ig G1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列,轻链Igκ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列,轻链Igλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列;以及3抗体基因可变区序列V_H、V_κ或V_λ。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框,将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞,72 h收集上清检测到表达的抗体。结论:构建的抗体基因线性表达框是无须克隆,快速高通量表达抗体基因进行筛选分析的策略。

乘积合并接收的差分跳频通信系统在瑞利衰落信道上抗多音干扰的性能分析

在瑞利衰落信道上,在多音干扰和加性高斯白噪声共存的条件下,对采用乘积合并接收(PCR)方法的差分跳频(DFH)通信系统的误符号性能进行了理论分析。为验证理论分析的正确性,进行了相应的计算机仿真,将采用 PCR 方法的误符号性能与采用线性合并接收(LCR)方法的误符号性能作了比较。结果证实,在瑞利衰落信道上,DFH 通信系统采用乘积合并接收的方法要比采用 LCR 方法具有更好的抗多音干扰的性能。

高效单链DNA探针在β－珠蛋白基因表达调控研究中的应用

直接以克隆的逆病毒载体为模板，在反应管中加入适当比例的α－３２Ｐ－ｄＡＴＰ及其他三种ｄＮＴＰ，以单引物进行线性聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增，标记与扩增同时进行，经过一轮ＰＣＲ（５０次循环），可得到高度特异及高效的单链ＤＮＡ探针。作者已将其成功地应用于人类β－珠蛋白基因表达调控的研究。

人工模拟条件下环境DNA宏条形码技术的定量分析初探

近年来,环境DNA宏条形码技术(eDNA metabarcoding)在水生生态系统生物多样性评估等相关领域中得到广泛应用,因其具有快速测算群落中物种丰度的潜能,eDNA宏条形码技术成为资源保护和管理中颇具应用前景的调查工具。虽然大量证据表明eDNA高通量测序获得的reads数与自然环境中生物相对数量具有相关性,但一直不能得到明确的量化关系结果。eDNA的富集、扩增过程中的偏倚等诸多不确定因素,制约了该技术在生物资源调查领域的推广应用。假定水体中的eDNA全部回收,且PCR扩增时不存在引物偏倚性,这种理想状态下的水体中eDNA组成与其高通量测序reads数是否存在线性关系?为此,本研究在实验室可控条件下,选择2个同属近缘的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和墨吉对虾(Penaeus merguiensis),对其DNA样品进行不同比例混合,模拟从自然水体中富集到的eDNA复合样品,既保证了样品的回收率,又降低了引物偏倚的干扰。以此为模板,探究eDNA宏条形码技术检测种群相对数量的准确性。结果显示,当2个物种DNA模板浓度比例为1∶1时,高通量测序结果注释得到的2个物种reads数比值为13/24(墨吉对虾/凡纳滨对虾),可见,即使是同属近缘种间依然存在轻微的引物偏倚现象,引物偏移率为1.5%。同时,根据7个实验组获得的高通量测序结果注释得到的2个物种reads数比值与对应模板中2个物种DNA浓度比值之间的线性回归分析表明,水体中eDNA组成与其高通量测序reads数间呈明显线性关系,即y=0.0716x+0.7043(r^(2)=0.9824)。综上所述,本研究为验证eDNA宏条形码技术监测水生生物资源量的可行性提供了直接证据,也为后续DNA宏条形码技术的定量研究提供了思路。