PDTC对ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和胆固醇流出的影响

目的研究核因子-κB(NF-κB)抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对THP-1巨噬细胞脂质蓄积和胆固醇流出的影响。方法 60 nmol/L PMA孵育THP-1巨噬细胞24 h后,分为3组:对照组、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组(100μg/mL)和PDTC组(100μg/mL ox-LDL+50μmol/L PDTC)。用油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,高效液相色谱分析法检测细胞内胆固醇水平,用液体闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出。结果PDTC抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积,明显降低细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量,增加载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)介导的胆固醇流出,但对HDL介导的胆固醇流出无明显影响。结论 PDTC抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积,促进apoA-Ⅰ介导的胆固醇流出。

ATP结合盒转运子A1与动脉粥样硬化(1)

ATP结合盒转运子A1(ABCA1)蛋白是一个由2 261个氨基酸组成的蛋白,含有2个核酸结合区,2个细胞外攀和含有6个螺旋的跨膜区。其功能是直接或间接介导胆固醇和磷脂通过细胞膜,再由载脂蛋白运走。人体50种组织中存在ABCA1 mR-NA,其转录受细胞多余胆固醇的调节,这种调节又受肝脏核受体(LXR)和视黄素受体(RXR)的调节。ABCA1不同部位的基因突变对其功能影响不同。在普通人群中ABCA1常见基因变异可能与高密度脂蛋白胆固醇水平,动脉粥样硬化发生有关。

人载脂蛋白A-I的原核表达及二级结构和功能鉴定

目的为获得高产量并具有正常结构和生物学活性的原核表达人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)。方法利用DNA重组技术对人apoA-Ⅰ的前8个氨基酸引入沉默突变,以pET-30b(+)为原核表达载体,在apoA-Ⅰ多肽链C-末端引入6×组氨酸标签,采用镍亲和层析对表达蛋白进行纯化。分别使用圆二色分析、浊度澄清试验和胆固醇外流试验对重组apoA-Ⅰ的α螺旋含量、脂质结合动力学及促细胞胆固醇外流能力进行评价。结果获得高表达产量的重组apoA-Ⅰ(12 mg纯化apoA-Ⅰ蛋白/L菌液);重组蛋白的α螺旋含量为(54±4)%,脂质结合动力学速率常数k1/2为0.059±0.002 min-1,胆固醇外流百分比为(16.68±1.77)%。结论可获得高产量并具有生物学活性的重组人apoA-Ⅰ;为构建apoA-Ⅰ其他突变体提供模式。

荷脂细胞胆固醇外向转运的工作模式

荷脂细胞外向转运胆固醇的能力是决定动脉粥样硬化进程与转归的关键。参与调控荷脂细胞胆固醇外向转运的蛋白质很多 ,经归纳、整理 ,我们提出“四个体系、一个中心、偶联转运、网络调控”的工作模式。即小凹蛋白 1胞内转运体系、三磷酸腺苷结合盒A1跨膜转运体系、高密度脂蛋白受体 (清道夫受体B1)跨膜转运体系、高密度脂蛋白—载脂蛋白A1胞外转运体系和小凹转运中心。以小凹为转运枢纽 ,小凹蛋白 1胞内转运体系首先将胆固醇从胞内转运到细胞膜 ,贮存于小凹 ;位于小凹中心的清道夫受体B1跨膜转运体系和三磷酸腺苷结合盒A1跨膜转运体系随后将胆固醇交给高密度脂蛋白—载脂蛋白A1胞外转运体系 ;四个转运体系之间进行网络调控。该工作模式为动脉粥样硬化性疾病的发生发展及治疗提供一个简明的工作思路。

黄芪多糖对巨噬细胞脂质代谢的影响及机制

目的分析黄芪多糖对巨噬细胞脂质代谢的影响及其机制。方法用不同浓度黄芪多糖处理巨噬细胞,氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育24h;将ATP结合盒转运子A1(ABCA1)siRNA转染巨噬细胞,qRT-PCR和Western blot检测ABCA1mRNA和蛋白的表达;油红O分析泡沫细胞水平;高效液相色谱检测脂质堆积;[3H]标记检测胆固醇流出。结果与对照组相比,黄芪多糖剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞的形成,同时胆固醇酯(CE)/总胆固醇(TC)比值明显下降,细胞内胆固醇的流出增加(P<0.05)。此外,研究结果显示,黄芪多糖使ABCA1蛋白表达增高(P<0.05),而抑制其表达后,黄芪多糖抑制的脂质堆积水平出现明显增加,同时伴随有胆固醇流出减少(P<0.05)。结论黄芪多糖可能通过调节ABCA1介导的胆固醇逆转运而影响巨噬细胞脂质代谢进程,提示其在易损斑块诱发的心脑血管疾病治疗中具有潜在应用价值。

MiR-34a靶向SIRT1促进THP-1人巨噬细胞的脂质蓄积并降低胆固醇流出的作用分析

目的探讨微小核糖核酸-34a(miR-34a)靶向沉默信息调节因子-1(SIRT1)促进THP-1人巨噬细胞的脂质蓄积并降低胆固醇流出的作用。方法体外培养THP-1细胞,分别将miR-NC、miR-34a inhibitor和miR-34a mimic转染到THP-1细胞,同时用佛波酯(160 nmol/L)孵育细胞24 h,诱导其分化成巨噬细胞;检测THP-1巨噬细胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表达,用红油O染色观察细胞内脂质蓄积情况,用高效液相色谱检测THP-1巨噬细胞内胆固醇水平,用闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出情况,同时检测THP-1巨噬细胞中SIRT1和肝脏X受体(LXR)蛋白含量。结果通过转染miR-34a inhibitor降低miR-34a后,THP-1巨噬细胞中红色脂滴明显减少,通过转染miR-34a mimic增加miR-34a后,THP-1巨噬细胞中可见大量的红色脂滴。通过转染miR-34a inhibitor降低miR-34a后,THP-1巨噬细胞中SIRT1mRNA表达、胆固醇流出率、SIRT1和LXR含量增加,THP-1巨噬细胞中总胆固醇(TC)、胆固醇酯(CE)和游离胆固醇(FC)含量降低(P<0.05);通过转染miR-34a mimic增加miR-34a后,THP-1巨噬细胞中SIRT1 mRNA表达、胆固醇流出率、SIRT1和LXR含量降低,THP-1巨噬细胞中TC、CE和FC含量增加(P<0.05)。结论通过转染促进miR-34a表达后,可以靶向抑制SIRT1,促进THP-1人巨噬细胞的脂质蓄积并降低胆固醇流出。

CyclophilinA对荷脂细胞胆固醇流出的影响

目的观察cyclophilinA在ox—LDL诱导的巨噬细胞荷脂过程中的蛋白表达对细胞内胆固醇流出的影响。方法实验采用荷脂细胞模型，以Westernblot法检测cyclophilinA蛋白的表达改变，高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化，放射性同位素法检测细胞内胆固醇流出情况。结果75rng／Lox—LDL与RAW264.7细胞共同孵育48h后．cyclophilinA的蛋白表达减弱，48、72h分别较未处理组下降了54．5％±6．3％、59．8％±5．9％，差异有显著性（P〈0．05）。细胞内胆固醇流出率未处理组是30．71％±0．71％，ox—LDL处理48、72h后依次下降为12．94％±0．59％、10．77％±0．35％，差异有显著性（P均〈0．05）。结论ox—LDL诱导的RAW264．7细胞荷脂过程中，cyclophilinA的蛋白表达下调与细胞内胆固醇流出密切相关。

成纤维细胞生长因子21通过诱导自噬促进泡沫细胞胆固醇流出

目的探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)促进泡沫细胞胆固醇流出的机制。方法在建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型的基础上,以不同浓度(0、50、100、200、400μg/L)FGF21处理泡沫细胞24 h,以200μg/L FGF21处理泡沫细胞不同时间(0、6、12、24、48 h),Western blot、激光共聚焦检测LC3,MDC染色分析自噬小体,HPLC、油红O染色测定细胞内胆固醇蓄积,液体闪烁计数分析胆固醇流出。结果 200、400μg/L的FGF21,以及200μg/L的FGF21作用24 h和48 h,泡沫细胞总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)水平均显著降低,而其胆固醇流出显著增强。机制研究发现,FGF21可诱导泡沫细胞自噬体形成,且微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3-Ⅰ)至微管相关蛋白Ⅱ轻链3(LC3-Ⅱ)转化率显著增加,但自噬相关基因5(ATG5)siRNA或3-甲基腺嘌呤(3-MA)或巴弗洛霉素A1(BafA1)干预自噬后,FGF21对TC、FC和CE的降低作用减弱,同时胆固醇流出减少,泡沫细胞脂质蓄积加重。结论 FGF21通过上调自噬促进泡沫细胞胆固醇流出。

肝脏调节胆固醇代谢稳态的研究进展

胆固醇代谢稳态是机体发挥生理功能的重要保障。胆固醇代谢紊乱引起的体内胆固醇异常积聚可导致肝脏脂肪病变以及高胆固醇血症,与动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展密切相关。肝脏在维持机体胆固醇代谢稳态过程中发挥着关键性作用,其胆固醇代谢涉及摄取、合成、生物转化以及外排等多个环节。文章就肝脏调节胆固醇代谢稳态的最新进展作一综述。

miR-497-5p靶向沉默核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出

目的观察miR-497-5p对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)靶向调控及其对细胞胆固醇流出的影响。方法生物信息学与荧光素酶报告基因验证miR-497-5p与NLRP1靶向结合。人源THP-1单核细胞经佛波酯及氧化低密度脂蛋白处理后成为泡沫细胞。使用miR-497-5p mimic和miR-497-5p inhibitor处理细胞。实时荧光定量PCR和Western blot检测NLRP1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达情况。酶联免疫吸附法测定细胞培养液白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18含量。液体闪烁计数仪检测泡沫细胞胆固醇流出水平。高效液相色谱法检测泡沫细胞内脂质含量。结果 miR-497-5p mimic能够显著性降低野生型NLRP1 3′UTR报告基因的荧光素酶活性。与对照组相比,miR-497-5p mimic组NLRP1、ASC、Caspase-1的mRNA及蛋白表达水平明显下调,IL-1β和IL-18分泌明显减少。miR-497-5p mimic较对照组显著促进细胞胆固醇流出,减少细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量。结论 miR-497-5p可能通过靶向调控NLRP1,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞炎症反应并促进胆固醇流出。

腺苷A_(2A)受体参与脂类代谢的研究进展

腺苷A_(2A)受体(A_(2A)R)属于G蛋白耦联受体,能够被细胞外的配体腺苷或腺苷类似物激活,通过激活下游Gs蛋白信号转导通路从而发挥各种生理学效应。A_(2A)受体广泛分布于肝脏、脂肪组织及免疫细胞中,在调控巨噬细胞胆固醇外排、炎症反应以及脂肪组织能量代谢等脂质代谢相关过程中发挥重要作用。本文主要对A_(2A)受体在机体脂类代谢中发挥的功能与作用机制进行总结,以促进对A_(2A)调控脂质代谢机制的进一步研究与靶向A_(2A)治疗脂代谢疾病的相关药物开发。

miRNA参与植物多酚改善脂代谢紊乱作用的研究进展

脂代谢紊乱是诱发肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等慢性代谢疾病的重要危险因素。Micro RNA(miRNA)作为一类短链非编码RNA,被发现可调控脂代谢在内的多项生理功能。有研究表明,miRNA可参与植物多酚类药物单体对脂代谢的调节,该文从甘油三酯合成、脂肪酸β氧化、胆固醇流出、胆固醇酯化等多种途径对植物多酚通过miRNA改善脂代谢紊乱,维护机体脂质平衡的作用机制进行归纳总结。将为应用和开发植物多酚的药物从而改善脂代谢紊乱相关疾病提供新的思路,并为miRNA为潜在靶点的药物研发来防治脂代谢紊乱相关疾病提供理论依据。

细胞因子与巨噬细胞脂质稳态

在动脉粥样硬化发生发展过程中,巨噬细胞发挥了重要作用。巨噬细胞泡沫化是动脉粥样硬化发生过程中的一个标志性事件。一旦巨噬细胞脂质稳态动态平衡被打破会引起细胞泡沫化。细胞因子可通过不同途径调控相应的酶或受体表达,以及细胞因子与巨噬细胞的相互作用,从而调控细胞脂质稳态。本文就近年细胞因子与巨噬细胞脂质稳态方面的研究进行综述。

阿托伐他汀对LPS诱导的RAW264.7细胞脂代谢相关蛋白及胆固醇流出的影响

目的研究阿托伐他汀对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7脂代谢相关蛋白表达及胆固醇流出的影响,并探讨其可能的作用机制。方法用不同浓度LPS刺激RAW264.7细胞,在不同时间点以Western blot方法检测脂质代谢相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B1、PCSK9和LDLR的表达,从而确定LPS最佳作用浓度和时间。Western blot检测不同浓度阿托伐他汀对50ng/m L LPS诱导的上述脂代谢相关蛋白表达变化的影响,激光共聚焦观察BODIPY荧光标记的胆固醇流出状况。结果在RAW264.7细胞中,LPS呈浓度和时间依赖性抑制ABCA1、ABCG1、SR-B1和LDLR蛋白的表达,对PCSK9蛋白表达无显著影响。阿托伐他汀浓度依赖性的上调LPS诱导的ABCA1、ABCG1、SR-B1和LDLR蛋白表达降低,上调PCSK9蛋白的表达,从而增加胆固醇流出,减少细胞内胆固醇聚集。结论阿托伐他汀干预能够改善LPS引起的脂代谢相关蛋白表达并增强胆固醇流出,该作用可能是其抗动脉粥样硬化机制之一。

miRNA-638对巨噬细胞内胆固醇外流的影响及其发生机制研究

背景流行病学研究表明生活方式、饮食结构等外部因素的改变与遗传因素相互作用导致人体脂代谢紊乱,而胆固醇逆转运过程能够维持体内胆固醇稳态。目的探讨miRNA-638对巨噬细胞内胆固醇外流的影响及其发生机制。方法实验于2016年9月-2017年9月完成。采用100 ng/ml佛波酯诱导人髓系白血病单核细胞(THP-1)贴壁并分化为巨噬细胞,根据预实验结果选取浓度为20 nmol/L的miRNA-638模拟物及其阴性对照物进行转染。采用NBD-胆固醇分别检测转染miRNA-638模拟物及其阴性对照物巨噬细胞经载脂蛋白AI(ApoAI)、高密度脂蛋白(HDL)及标准血清外流液介导的胆固醇外流率;采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测转染miRNA-638模拟物及其阴性对照物巨噬细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)、三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)和极低密度脂蛋白受体(VLDLR)mRNA及其相对表达量。结果转染miRNA-638模拟物巨噬细胞经ApoAI外流液介导的NBD-胆固醇外流率低于转染阴性对照物巨噬细胞(P<0.05);转染miRNA-638模拟物巨噬细胞与转染阴性对照物巨噬细胞经HDL、标准血清外流液介导的NBD-胆固醇外流率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。转染miRNA-638模拟物巨噬细胞的ABCA1、ABCG1、VLDLR mRNA相对表达量低于转染阴性对照物巨噬细胞(P<0.05)。转染miRNA-638模拟物巨噬细胞中ABCA1、ABCG1相对表达量低于转染阴性对照物巨噬细胞(P<0.05);转染miRNA-638模拟物巨噬细胞与转染阴性对照物巨噬细胞中VLDLR相对表达量比较,差异无统计意义(P>0.05)。结论miRNA-638可减少由ApoAI介导的巨噬细胞内胆固醇外流,该作用可能是通过调控ABCA1/ABCG1的表达实现的。

黄芩苷及其固体脂质纳米粒在Caco-2细胞上的吸收机制研究

目的通过建立体外Caco-2细胞模型研究黄芩苷(BA)及其固体脂质纳米粒(SLN)的吸收特性。方法利用CCK-8法、LDH法筛选BA及BA SLN在Caco-2细胞单层模型的合适浓度。采用高效液相色谱法测定BA含量,分别研究时间、浓度、温度、内吞抑制剂及外排抑制剂对其摄取、转运量的影响;利用Western blot法检测外排蛋白的表达量。结果在50~150μg·mL-1,BA及BA SLN摄取呈浓度依赖性;在4~37℃,BA及BA SLN的细胞摄取量随温度升高而增加;内吞抑制剂影响BA SLN的细胞摄取量;多药耐药相关蛋白2(MRP2)抑制剂和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)抑制剂显著降低BA外排率,对BA SLN外排率无影响;BA SLN降低细胞MRP2、BCRP表达量。结论BA在Caco-2细胞模型的吸收为被动扩散,并伴随能量依赖,与MRP2、BCRP外排有关。BA SLN显著增加药物在细胞模型的吸收,可能与其增加内吞、抑制细胞外排蛋白表达减少药物外排有关。