Lipofectin介导DNA聚合酶α反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长

目的 研究阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｐ）介导的ＤＮＡ 聚合酶α（ＤＮＡ－ ｐｏｌα） 反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）体外抑制人胃癌细胞的生长。方法 合成与人ｐｏｌ α催化亚基ｍＲＮＡ 翻译起始区１８ 个碱基互补的寡核苷酸（ＯＤＮ） ，与Ｌｉｐ 混合制备Ｌｉｐ＋ ＯＤＮ复合物，作用于ＭＧＣ－８０３、ＳＧＣ－７９０１ 人胃癌细胞２４ ｈ 后，细胞换液，继续培养２４ ｈ，用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法测细胞存活状态，流式细胞术（ＦＣＭ）分析癌细胞ＤＮＡ含量。结果 １０ μｇ／ｍｌｐｏｌα特异的ＡＳＯＤＮ在Ｌｉｐ 介导下可显著抑制人胃癌细胞的ＤＮＡ复制和细胞增殖，正义ＯＤＮ（ＳＯＤＮ） 无此作用。结论 ＤＮＡ－ ｐｏｌα特异ＡＳＯＤＮ可用于胃癌的基因治疗， 阳离子脂质体可促进ＡＳＯＤＮ大量进入癌细胞， 增强其生物效应。

Lipofectin介导bcl-xL反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞的影响

目的 :探讨阳离子脂质体Lipofectin对bcl xL反义寡核苷酸进入CNE 2Z细胞的影响。方法 :采用阳离子脂质体Lipofectin介导bcl xL反义寡核苷酸转染CNE 2Z细胞 ,应用MTT法观察Lipofectin介导前后对CNE 2Z增殖的影响 ;RT PCR检测处理前后bcl xLmRNA表达水平。结果 :Lipofectin介导bcl xl反义核酸可提高反义核酸对细胞的增殖抑制率 ;Lipofectin介导bcl xL反义核酸可增强反义核酸下调bcl xLmRNA表达水平的能力。 结论 :Lipofectin可促进反义核酸转染进入细胞。

Lipofectin介导tk基因转移使B16细胞获得对GCV的敏感性

用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将真核表达质粒ｐＣＭＶ－ＨｙｇｒｏＴＫ导入小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６，用潮霉素Ｂ筛选出阳性克隆。聚合酶链式反应检测ｔｋ基因的存在，并在倒置显微镜下动态观察了核苷类似物丙氧乌苷（ＧＣＶ）对ｔｋ￣－和ｔｋ￣＋的Ｂ１６细胞的作用。结果表明，ｔｋ￣＋的Ｂ１６细胞获得了对ＧＣＶ的敏感性，ｔｋ基因／ＧＣＶ使细胞死亡具有“旁观者效应”。

用Lipofectin Reagent转染猪子宫上皮细胞

本文用Lipofectin Reagent作为转染细胞的间型脂质,使Liposome与SV40 ts A209 DNA形成一种混合物转染猪子宫上皮细胞。此法比用磷酸钙和二乙氨乙基葡聚糖转染细胞的方法简单,高效、重复性好。转染后的猪子宫上皮细胞形状和大小略有改变;对温度敏感,用相同培养液培养7天,在33℃条件下细胞的生长速度是在40℃时的5倍.

Genetic transformation of Brussica oleracea by lipofectin-mediated direct plasmid uptake

The efficient transfer of nucleic acids into plant protoplast is a critical problem for thedevelopment of transformation techniques. Besides the well-used PEG-mediatedtransformation and electroporation, with the special characteristics (man-made, steadiness,

脂质体介导鸡精子与外源DNA的结合

脂质体介导鸡精子与外源ＤＮＡ的结合刘红林１陈宜峰１姜志华２丁波２黄月英２（南京师范大学生物系南京２１００９７）（南京农业大学动物科学系南京２１００９５）２精子充当外源ＤＮＡ的载体提出了一条新的基因转移途径。由于这个构想方法学非常简单，利用人工授精程序...

脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法

目的提高脂质体介导的细胞转染效率。方法在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测。结果流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率(26%、24%和40%)高于传统法转染的细胞(16%、16%和18%)。改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%。在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短。结论改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在最短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株。

硫代反义寡核苷酸在细胞培养内抗甲型流感病毒活性

为了研究抗流感病毒特异性反义核酸药物，针对Ａ型流感病毒基因组３′和５′端保守序列，设计并合成了４条硫代寡核苷酸（ＯＤＮ）：３′端反义ＯＤＮ（ＩＶ３＃）与３′端正义ＯＤＮ（ＩＶ３Ｓ），５′端反义ＯＤＮ（ＩＶ４＃）与５′端正义ＯＤＮ（ＩＶ４Ｓ）。以流感病毒血凝滴度和致细胞病变作用为指标，测定了ＯＤＮｓ在ＭＤＣＫ细胞中对Ａ型流感病毒Ａ／京防／８６－１（Ｈ１Ｎ１）复制的影响。结果表明，与流感病毒基因组５′端互补的ＯＤＮＩＶ４＃为１μｍｏｌ／Ｌ时，对病毒复制抑制率近５０％，为１０μｍｏｌ／Ｌ或更高时，抑制率超过７０％，ＩＶ４＃抑制病毒活性呈序列和剂量依赖性。为了提高ＩＶ４＃的细胞摄取效率，对其进行脂肪链修饰，并在ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染条件下考察了对病毒的抑制作用。结果发现，脂肪链修饰的ＩＶ４＃抑制病毒活性无明显增高；ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ能显著提高ＩＶ４＃及其脂肪链修饰物抑制病毒活性。

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。

影响水牛胎儿成纤维细胞转染效率的因素

实验对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行了系统摸索,获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms,电场强度为40～50V/m时,细胞的死亡率处于20%～50%之间,比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL:2μg,可获得较高的转染率。相同培养条件下,脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落,转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。

人胚胎中枢神经系统NOV mRNA神经元的发育——原位杂交研究

目的研究人胚胎中枢神经系统ＮＯＶｍＲＮＡ神经元的发育。方法地高辛标记的ｃＲＮＡ探针原位杂交技术。结果（１）脊髓：第１６周人胚胎脊髓腹侧出现ＮＯＶｍＲＮＡ神经元，为大型神经元，至第２８周扩展到后角中间神经元，第３８周中央灰质中阳性神经元明显。（２）延髓：第１６周延髓观察到下橄榄核、舌下神经核、迷走神经背核均有阳性神经元分布，至第２８周，三叉神经脊束核和楔束副核检测到阳性神经元；（３）脑桥、中脑和间脑：第３２周脑桥展神经核、中脑红核和黑质、丘脑腹外侧核和背内侧核均有阳性神经元分布。（４）大脑：第３２周纹状体有较多标记神经元，第３８周大脑皮质顶叶阳性神经元明显。以上结果表明ＮＯＶｍＲＮＡ神经元在人胚胎中枢神经系统中，首先在低级中枢出现，在高级中枢中逐渐发育；各胎龄标本中所观察到的阳性神经元多位于支配躯体运动的神经核团；随着胚胎中枢神经系统的发育，ＮＯＶｍＲＮＡ神经元逐渐增多，这与其他原癌基因在胚胎发育的早期表达高，而后降低不同。结论在人胚胎发育过程中ＮＯＶ基因对神经系统的分化和进一步的功能活动可能起重要调节作用，且这种作用逐渐增强。

bFGF/Math1基因表达载体的构建及在大鼠耳蜗中的表达

目的 构建含有碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和Math1基因的真核共表达载体 ,并用阳离子脂质体包裹将其导入大鼠耳蜗 ,观察其表达情况。方法 应用基因重组技术和限制性内切酶酶切 ,构建并鉴定PRK5 -bFGF -Math1真核共表达载体。经脂质体介导转染大鼠耳蜗后 ,用逆转录 -聚合酶链反应 (reversetranscription -polymerasechainreaction ,RT -PCR)法检测其表达情况。结果 阳性重组子经酶切鉴定含有bFGF和Math1基因 ,RT -PCR结果表明bFGF和Math1在耳蜗中均有表达。结论 本文成功地构建了含有bFGF和Math1基因的真核共表达载体 ,且在哺乳动物耳蜗中均有表达。

c-erbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的 :探讨癌基因c -erbB2的反义寡苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法 :设立c -erbB2正义寡核苷酸组和非处理组作对照 ,用RT -PCR检测卵巢癌细胞处理前后c -erbB2表达水平的变化。用MTT法及平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株SKOV3在脂质体c-erbB2反义寡核苷酸作用前后受60 Coγ射线不同剂量照射后的细胞存活分数和集落形成率。结果 :c -erbB2反义寡核苷酸能抑制c-erbB2癌基因的表达 ,经脂质体介导的c-erbB2反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其存活分数和集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P <0 .0 1) ,而转染c -erbB2正义寡核苷酸组的存活分数和集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :c -erbB2反义寡核苷酸通过抑制c -erbB2的表达降低人卵巢癌细胞株SKOV3放射抗拒性。该作用可能与c-erbB2反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关。

脂质体介导ANG反义核酸对A549细胞作用的研究

目的 研究脂质体介导ANG反义核酸转染A5 49细胞后 ,对其中ANG蛋白表达的影响 ,探讨其作为抗血管生成与抗肿瘤药物的可行性。方法 用人工合成的人ANG反义寡聚核苷酸 ,以脂质体为载体转染人肺癌A5 49细胞 ,研究A5 49细胞在基因转染后 ,其ANG蛋白表达的变化。结果 脂质体转染程序优化后 ,得到最佳转染效率 ;免疫组化显示细胞内ANG蛋白表达明显减少 ;培养基ELISA检测显示每细胞分泌的ANG蛋白量与对照组相比有显著差异。结论 ANG反义寡聚核苷酸抑制A5 49细胞中ANG的表达 。

鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达

特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp～ +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp～ +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P2 9koval GFP和P1 5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用 ,也显示卵清蛋白启动子对输卵管上皮细胞和卵巢细胞不存在特异性 ,并且不存在种属差异性。

EGFR反义寡核苷酸对人视网膜神经胶质细胞增生的影响

目的 观察表皮生长因子受体 (epiderm al growth factor receptor,EGFR)反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotide,ASODN)对人视网膜神经胶质 (retinal glial,RG)细胞增生的影响。方法 人视网膜神经胶质细胞的原代培养 ,用脂质体 (L ipofectin)作为载体将修饰型 EGFR ASODN转染 RG细胞后 ,MTT法测细胞增生活性 (吸光度 A值 )的变化 ,流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果 EGFR ASODN转染 RG细胞后 ,细胞的增生活性降低 ,对 RG细胞生长增生的抑制率约为 46 .5 % ,进入 S期的细胞减少。结论 EGFR A-SODN能够抑制人

阳离子脂质体介导NF-κB“decoy”ODNs转染巨噬细胞条件的优化

目的 :观察 NF- κB“decoy”ODNs在阳离子脂质体 lipofectin介导下转染小鼠巨噬细胞 J774 .1的优化参数以及在细胞内的分布。 方法 :改变 ODN与 lipofectin比率、转染时间 ;用流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度和摄取率评价转染效率 ;荧光显微镜观察细胞内荧光分布 ;测定细胞上清乳酸脱氢酶 (L DH)观察细胞损伤情况。 结果 :lipofectin介导转染显著提高 J774 .1细胞对 NF- κB“decoy”ODNs的摄取 ;在 2 4孔培养板中 ,NF- κB“decoy”ODNs与 lipofectin比率 (W/ W)为 1∶ 5、转染 6 h时 ,转染效率最佳而细胞毒性相对较低 ;lipofectin介导转染 6 h后 ,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核和部分细胞质中 ,而直接转染时荧光物质多分布于细胞质。结论 :lipofectin可增加 NF-κB“decoy”ODNs的细胞摄入并改变其细胞内分布 ;NF-κB“decoy”ODNs与 lipofectin比率 (W/ W)为 1∶ 5、转染 6 h时可获得最佳转染效率。

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的,利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin基因,得到的β-actin基因片段SZ21包含启动调控区,大小为2398bp。SZ21的启动调控区包括β-actin基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA框和CArG框等元件。对启动子序列在线分析表明,获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子,将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上,构建成重组表达载体β2pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明,克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实,克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性,在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA,均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。

脂质体介导转染的绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内的表达

目的研究脂质体转染法对骨髓基质细胞进行基因修饰的可行性。方法在体外分离和扩增大鼠骨髓基质细胞,用脂质体转染法介导绿色荧光蛋白基因进入到骨髓基质细胞内,荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达,台盼兰排斥试验检测转染细胞的活力。结果绿色荧光蛋白可以在大鼠骨髓基质细胞内表达,转染效率为(28.9±3.6)%;脂质体法转染后的细胞活力为(93.6±4.8)%。结论脂质体转染法可以介导外源基因进入到骨髓基质细胞内表达。

修饰和导入技术对于反义寡核苷酸的影响

合成了３′末端三个磷酸二酯键硫代修饰的针对ＤＮＡ聚合酶α的反义核苷酸ＡＳα，利用［３Ｈ］ＴｄＲ参入方法测定了ＡＳα对于ＨｅＬａ细胞ＤＮＡ复制的抑制效力。结果表明，这种修饰明显增强了寡核苷酸在含血清的细胞培养液中的稳定性。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ能够促进ＡＳα的入胞并且增强其抑制效力。