Lipopeptide Antibiotics Produced by the Engineered Strain Bacillus subtilis GEB3 and Detection of Its Bioactivity

MALDI-TOF-MS technology was used for identification of lipopeptide antibiotics producedby GEB3 strain, a derivative of Bacillus subtilis 168 which was transformed by lpaB3gene. The result showed GEB3 only produced lipopeptide antibiotic surfactin. The analysisby LC-MS demonstrated that GEB3 produced standard surfactin isoforms with side chainlengths of 13,14 and 15 carbon atoms. The bioactivity detection of surfactin indicatedthat the surfactin produced by GEB3 had inhibition effect on plant pathogens Rhizoctoniasolani and Pyricularia oryzae.

枯草芽孢杆菌Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制效果研究

白粉病和炭疽病是影响天然橡胶生产的重要病害。为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用,以橡胶种苗‘热研7-33-97’为试验材料,通过共培养法研究菌株Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长发育的影响,并采用脂肽粗提物和孢悬液法进行离体和盆栽试验评价其对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用。结果表明,Czk1脂肽类粗提物可导致橡胶树炭疽病菌菌丝畸形和断裂,抑制病菌的最低质量浓度为40 mg·L^(-1),抑制其分生孢子萌发EC_(50)值为3.80 mg·L^(-1);40 mg·L^(-1)的Czk1脂肽类粗提物对橡胶树炭疽病菌孢子萌发抑制率达68.84%。脂肽粗提物质量浓度在1000 mg·L^(-1)时,可使盆栽和离体试验中炭疽病发病率降低43.40%和49.90%,同时亦使白粉病病情指数降低32.60和21.60,对橡胶树白粉病的防治效果为45.60%。由此表明,菌株Czk1脂肽物质能有效降低橡胶树炭疽病和白粉病发病率、抑制病菌生长并延缓病情的扩展,具有防治橡胶树叶部病害的良好生防潜力。

一株耐酸性拮抗细菌的筛选、鉴定及对茄雷尔氏菌的抑制作用

为解决酸化烟田青枯病防控难的问题,本研究通过生防菌快速筛选法获得一株耐酸性的拮抗细菌CLP-6,采用扫描电镜观察其拮抗活性,利用HPLC-MS技术确定胞外抑菌物质种类和含量,荧光定量PCR法检测筛选菌株对青枯菌的抑制效果。结果表明,该菌株胞外抑菌物质可降解青枯菌杆状菌体并致其死亡,pH 5.5条件最适宜该菌株生长,且胞外抑菌蛋白和抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产量高。pH 5.5和pH 7.0土壤盆栽试验结果显示,在供试时间范围内,CLP-6能有效降低烟草根际土壤和茎基内青枯菌数量,且pH 5.5时抑菌效果更强,其中,接种192 h时,CLP-6处理烟草根际土壤青枯菌数量较CK处理分别减少98.12%和96.25%;接种144 h时,pH 5.5土壤条件下CLP-6处理烟草茎基内青枯菌数量最低,且显著低于CK处理。16S rRNA,rpoD和rpoB多基因序列联合鉴定CLP-6为防卫假单胞菌(Pseudomonas protegens)。新型耐酸性防卫假单胞菌CLP-6在减轻连作酸化土壤青枯菌侵染和提高烟草青枯病绿色防控效果具有重要开发前景。

苏云金芽胞杆菌抗菌脂肽初步鉴定及抑菌活性测定

植物枯萎病是影响作物生长的重要因素,利用植物内生菌拮抗病原菌生长,从而降低其危害程度是目前研究的热点。本研究从健康的番茄植株中筛选分离得到一株对番茄枯萎病病原菌有较强拮抗作用的内生细菌B-R1,通过形态学、生理生化以及分子生物学检测分析,鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。为进一步探索该菌株的生防作用,首先将菌株发酵后离心,得到发酵上清液,采用盐酸沉淀法对其活性物质进行粗提,并检测其对大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌活性。通过薄层色谱法(TLC)、傅里叶红外光谱(FI-TR)、高分辨液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析并鉴定活性物质的结构。结果表明,苏云金芽胞杆菌对尖胞镰刀菌有良好的抑制作用,结构分析初步鉴定抗菌物质中含有丰原素(fengycin),属于脂肽类抗生素。

解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用

【目的】从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean^(TM) LC^(-1)8柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L^(-1);70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L^(-1);100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L^(-1)。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13—C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9Da,是C15—C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13—C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·m L^(-1) bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·m L^(-1)surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·m L^(-1),发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。

解淀粉芽胞杆菌MH71的生防活性及脂肽类抗生素基因检测

从漠河多年永冻土层采集的冻土样品中分离的拮抗菌解淀粉芽胞杆菌MH71,对多种植物病原真菌和细菌具有较强的拮抗作用。本文对该菌株的生防活性相关特性及其对番茄灰霉病的离体防效进行了研究,同时,应用特异性引物对MH71中脂肽类抗生素合成有关基因进行检测。结果表明,该拮抗菌产生嗜铁素、蛋白酶、纤维素酶和吲哚-3-乙酸(IAA),不产生磷酸酯酶和几丁质酶;番茄离体叶片第5天调查结果表明该菌发酵液对番茄灰霉病的防效为92.8%,而在番茄果实上第7天和第11天调查的结果表明,与清水对照对比,发酵原液、发酵液5倍稀释液与50%啶酰菌胺1 000倍液化学农药对番茄灰霉病均有良好的防治效果,防效均为100%;从该菌的基因组DNA中扩增得到了fenB、mycB、ituA、sfp等脂肽类抗生素合成酶基因。此研究结果为该拮抗菌生防潜力的深入评价及活性物质的分离、鉴定和番茄灰霉病的生物防治提供了重要的参考资料。

枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素-iturin A的纯化及电喷雾质谱鉴定

枯草芽孢杆菌JA产生的抗生素对植物病原真菌具有广谱抗性,明确抗生素的种类是进一步研究的基础。用6mol/L盐酸沉淀JA菌株的去菌体培养基,再用甲醇抽提获得抗生素的粗提物。利用反相HPLC系统,将粗提物过DiamonsilC18柱,收集有抗小麦赤霉病等病原真菌活性的化合物1、2。运用电喷雾质谱法(ESI/MS)测得其分子量分别为1042.4D和1056.5D。再利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片,结果表明分子量为1042.4D的化合物一级结构为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸),属于脂iturin A。化合物1、2为相差一个亚甲基(-CH2)的iturinA同系物。研究结果提供了一种从枯草芽孢杆菌发酵液中快速分离纯化和鉴定脂肽类抗生素iturin A的新方法。

金属离子和磷酸盐对脂肽类抗生素FW99608生物合成的影响

不同金属离子和磷酸盐对脂肽类抗生素 FW996 0 8产生菌 Streptomyces sp.FIM996 0 8的发酵效价有不同影响。在有机发酵培养基中加入一定浓度 Cu2 +、Co2 +、Zn2 +以及 K2 SO4 能明显提高 Streptomycessp.FIM996 0 8的发酵效价并促进其菌丝生长。然而 ,Ca CO3和 K2 HPO4 · 3H2 O明显抑制脂肽类抗生素 FW996 0 8的生物合成。

万隆霉素抑制细菌的作用机理初探

以革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌MIGI.22(Bacillus subtilis)和革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas ovyzaepy)为研究对象,对万隆霉素的抑菌机理进行了初步研究。结果表明,万隆霉素可显著抑制这2种细菌的氧呼吸作用,随着反应体系中万隆霉素终浓度由0逐渐增加到50μg/mL,枯草芽孢杆菌氧呼吸作用持续的时间由对照的28 min减小到10 min,白叶枯病菌则由18 min减小到8 min,两者的相对耗氧量分别由对照的86.9%和62.9%逐渐下降到0;此外,对这2种细菌NADH氧化酶活力进行的研究表明,万隆霉素可显著抑制细菌各个生长阶段酶的活力的提高,这与万隆霉素抑制其氧呼吸作用密切相关。

枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺优化

[目的]枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)T-500是1株对水稻纹枯病和稻瘟病均有良好防治效果的生防菌,通过优化其摇瓶发酵工艺,从而提高发酵液中脂肽类抗生素的含量,为T-500菌株生防制剂的开发提供技术支撑。[方法]以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)为指示菌,利用酸沉淀法提取T-500菌株发酵液中的脂肽类抗生素,并进行脂肽抗生素粗提液的抑菌效果分析,筛选影响抑菌效果的发酵培养基主成分;随后通过Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计和响应曲面法,优化T-500菌株高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分和发酵条件。[结果]T-500菌株高产脂肽类抗生素的最佳培养基为:黄豆饼粉7.00 g·L^(-1),蛋白胨4.92 g·L^(-1),酵母粉1.90 g·L^(-1),小麦粉5.00 g·L^(-1),玉米糊5.00 g·L^(-1),NaCl 1.00 g·L^(-1),MgSO_40.20 g·L^(-1),MnSO_45.0 mg·L^(-1),FeSO_40.5 mg·L^(-1)。最佳发酵培养条件为:装液量500 mL三角瓶装105 mL,接种量0.87%,发酵时间41.35 h,温度28℃,转速180 r·min^(-1)。利用最佳摇瓶发酵工艺,T-500菌株所产生的脂肽类抗生素对纹枯病菌的抑菌带最宽,达(11.23±0.15)mm,菌含量达(7.41±1.18)×109CFU·mL^(-1)。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证,理论预测值与实际值无显著差异。质谱和色谱检测表明:优化发酵工艺后产生的Surfactin含量较基础培养基提高了48.2%,Iturin含量较基础培养基提高了180.9%;优化发酵工艺后检测到了Fengycin的产生,但优化前未发现Fengycin的产生。[结论]利用响应曲面法成功优化了枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺;优化后,T-500产脂肽类抗生素产量增加,抑菌活性增强。

油菜内生菌BY-2的脂肽类抑菌物质的分子结构鉴定

对油菜内生枯草芽孢杆菌BY-2(Bacillus subtilis)的细胞外分泌型抗菌性纯化物进行双缩脲反应、茚三酮反应、高效液相色谱仪(HPLC)分离、质谱分析和异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生HPLC分析。结果显示:BY-2的胞外分泌型抑菌物质含肽键,具有环状分子结构。在甲醇/水的流动相条件下,1.969min出现1个抑菌成分峰值;在三氟乙酸/甲醇流动相条件下,抑菌成分形成了6个峰值。组成分析结果表明:该抑菌物质由分子量分别为995Da、1009Da、1023Da、1037Da、1051Da和1087Da六种成分构成,其4种氨基酸比例为:天冬氨酸∶谷氨酸∶缬氨酸∶亮氨酸=1∶1∶1∶1.5。该抑菌物质可归类为环脂肽类抗生素(Cycle lipopeptide)中的枯草菌表面活性素(Surfactin),其中的1087Da大分子同系物尚未见报道。

枯草芽孢杆菌E1R-j产抗菌脂肽发酵条件的优化

通过对Bacillus subtilis E1R-j产脂肽物质的发酵条件的优化来提高脂肽物质产量,从而为工业化生产奠定基础。在Landy培养基中,采用单因素试验法确定对E1R-j菌株产脂肽物质的影响因素及水平,结合响应面法确定最佳发酵条件。结果表明,温度40℃、培养基初始pH 9.0、接种量3.0%、装液量50mL、转速200r/min为最佳发酵条件。在最佳发酵条件下培养,粗脂肽物质的质量浓度达1.39g/L,是原发酵条件下质量浓度0.55g/L的2倍多。优化后的培养条件提高了B.subtilis E1R-j产粗脂肽物质的量,表明响应面法是一种快速、有效、简单的优化方法。

脂肽类抗生素及其作用机制

脂肽类抗生素是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物活性物质,含有由亲水性氨基酸和疏水性脂肪酸链组成的特殊分子结构,表现出亲水、亲脂两亲性的特性,具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒等多种生物学活性,作为抗菌药物和肿瘤抑制剂在医药和临床应用领域具有良好的应用潜力和前景。本文对脂肽类抗生素的结构、生物学功能和作用机制等最新研究进展进行综述。

复方大黄配伍抗生素腹腔灌注法治疗急性出血坏死性胰腺炎的实验研究

目的 :实验观察大黄复方与抗生素配伍腹腔灌注对急性出血坏死性胰腺炎 (ANP)的作用。方法 :制备ANP模型 ,随机分组后分别以腹腔灌注给药 ,以ELISA法及鲎试验法检测血浆或组织中白细胞介素 6 (IL 6 )和内毒素脂多糖 (LPS)水平。结果 :各治疗组IL 6、LPS水平均明显低于实验对照组 (非治疗组 )。结论 :大黄复方配伍头孢哌酮钠腹腔灌注法对ANP大鼠内毒素和炎性介质的产生有一定的抑制作用。

β-内酰胺类抗生素诱导革兰氏阴性菌释放内毒素对其疗效的影响

探讨β-内酰胺类抗生素在诱导革兰氏阴性菌释放内毒素 (L PS)及对感染动物保护效能方面的差异 ,旨在为临床上防治革兰氏阴性菌感染时正确选择抗生素提供实验依据。将 Wistar大鼠背部做 30 %TBSA( °)烫伤 ,创面立即涂铜绿假单胞菌 (PA10 3)悬液 1ml(1× 10 9CFU) ,72 h后制成大鼠烧伤创面脓毒症模型。烧伤脓毒症大鼠随机分为单纯抗生素治疗组、半乳糖胺 (Gal N)敏化后治疗组及爱兰苔胶 (CGN)封闭后治疗组。分别用亚胺培南 (IMP,5 mg)和头孢他啶 (CTZ,10 mg)单剂量腹腔注射 (i.p.)治疗 ,对照组施以等量无菌生理盐水 ,同时 ,敏化组加用 Gal N 5 0 mg i.p.,以增强大鼠对 L PS的敏感性 ,封闭组在敏化组的基础上加用 CGN 1mg i.p.,以阻断 L PS的生物学效应。于抗生素治疗前及治疗后 3、6及 9h抽静脉血 ,检测血中细菌浓度 ,血浆 L PS水平 ,并观察敏化组和封闭组大鼠 10 d后的死亡率。结果 IMP和 CTZ均能使大鼠血中菌量显著降低 ;IMP和 CTZ在杀菌过程中均能诱导 PA10 3释放大量 L PS,但 CTZ组血浆 L PS水平显著超过相应的IMP组 (P<0 .0 5或 P<0 .0 1) ;与此同时 ,敏化组大鼠的死亡率 CTZ组明显高于 IMP组 (P<0 .0 5 ) ,而在封闭组 ,两者间的这种差异则消失 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,同属β-内酰胺类的 IMP和

作物病害高效生防菌株的定向快速筛选及其种类鉴定

[目的]筛选和鉴定能产Bacillomycin D的芽孢杆菌。[方法]通过PCR技术对36株具有抑菌活性的芽孢杆菌进行检测,筛选出具有Bacillomycin D合成酶基因的菌株,并利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)对筛选出的菌株进行检测,最后通过16S rDNA和gyrB基因序列对这些菌株进行分子鉴定。[结果]共筛选出4株能产生Bacillomycin D的菌株,其中2株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),2株为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。[结论]该研究为高效微生物农药的开发奠定了基础。

头孢曲松钠对小鼠肠道菌群组成及代谢的影响

采用头孢曲松钠灌胃诱导小鼠肠道菌群失调,研究抗生素对小鼠肠道菌群组成及代谢的影响。通过宏基因组分析小鼠肠道菌群组成;气相色谱法测定小鼠粪便中短链脂肪酸的质量分数;ELISA试剂盒测定小鼠血清中脂多糖浓度。抗生素灌胃后可引起小鼠粪便中厚壁菌门增加,拟杆菌门减少;乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸质量分数下降;血清中脂多糖浓度升高。抗生素造成的小鼠肠道菌群紊乱,可导致有害菌的丰度增加并抑制益生菌生长;肠道菌群紊乱可导致短链脂肪酸质量分数下降及脂多糖浓度升高,促进炎症的发生。

以脂磷壁酸为靶点的新抗筛选模型的建立和应用

目的 :根据达托霉素的作用机制 ,寻找与糖肽类抗生素无交叉耐药性的新抗生素。方法 :本实验建立了以脂磷壁酸为靶点的新抗筛选模型 ,并通过脂磷壁酸合成抑制模型对所筛得的阳性菌株进行复筛验证。结果 :从 12 0 0株放线菌中筛选到 2株阳性菌株 ,初步证明其抗菌活性显示出Ca2 + 依赖性 ,并在脂磷壁酸合成抑制模型上显示一定的抑制活性。结论 :阳性菌株 15 10和 16 15活性成分对MRSA等细菌具有良好的抗菌活性 ,值得深入研究。

枯草芽孢杆菌F-2抗植物病原真菌活性物质的研究

枯草芽孢杆菌F-1和F-2与尖孢镰刀菌的对峙实验中,F-1没有抑菌作用,而F-2表现出强抑菌效果.为了分析测定F-2的抑菌活性物质,对F-1和F-2胞外代谢物粗提液的HPLC谱图进行比较,发现F-2具有F-1所没有的特征代谢产物.使用LC-MS对F-2的特征产物进行分析,推测主要产物的分子量为1477.0、1489.1和1505.1.进一步采用MALDI-TOFMS对F-2粗提液进行分析,发现F-2产生两组分子量相差14Da(CH2)的同系物.其中一组的分子量依次为1462.8、1476.8、1490.8、1504.8和1518.9,通过质量指纹谱技术鉴定为脂肽抗生素C14-18 Fengycin B.另一组的分子量依次为1432.8、1446.8、1460.8、1474.8和1488.9,与C14-18 Fengycin A对应分子分子量相差2Da,推测可能是Fengycin A的一种异构体,其碳链中具有一个双键,具体性质有待进一步分析.

基因工程菌枯草芽孢杆菌GEB3产生的脂肽类抗生素及其生物活性研究

利用MALDI TOF MS技术 ,鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明 ,GEB3仅产生表面活性素 (surfactin) 1种脂肽类抗生素。经LC MS分析 ,GEB3产生由 13、14和 15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体 (standardsurfactinisoforms)。生物活性检测表明 。