食品中弓形虫和旋毛虫液相基因芯片检测方法的研究

为建立一种可同时检测食品中弓形虫和旋毛虫的液相基因芯片方法,本研究以弓形虫B1基因和旋毛虫18S rDNA基因为靶序列,设计并合成特异性探针和引物,通过PCR方法扩增目的片段并测序,建立一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法。结果显示:在约180bp和90bp处分别扩增出目的条带;测序结果与GenBank登录的弓形虫和旋毛虫的相关基因一致性分别为99.47%和100%;液相基因芯片对单重PCR产物和双重PCR产物的检测结果一致,特异性和重复性良好。应用该方法检测弓形虫和旋毛虫变异系数(CV%)均在7%以内;灵敏度分别为65.6ng/mL和39.06ng/mL,比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约8倍;模拟污染试验准确率达98%以上。本研究建立的液相基因芯片检测食品中弓形虫和旋毛虫的方法具有高效、灵敏和特异等优点,为食源性寄生虫的检测和监控提供了新方法。

猪囊尾蚴和华支睾吸虫液相基因芯片检测方法的建立

为建立一种可以同时检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,本研究以猪囊尾蚴ITS基因和华支睾吸虫ITS基因为靶序列,设计并合成特异性探针和引物,通过PCR方法扩增目的片段,构建阳性重组质粒标准品并对其进行测序,建立一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法。结果显示,扩增目的片段长度分别约为150 bp和170 bp,测序结果与Gen Bank登录的猪囊尾蚴和华支睾吸虫相关基因一致性分别为99.35%和98.27%;液相基因芯片对单重PCR产物和双重PCR产物的检测结果一致,特异性和重复性良好。应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的灵敏度分别为5.13×104拷贝/μL和2.03×104拷贝/μL,比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约8倍;应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的变异系数均在8%以内,模拟污染样品的检验试验准确率达98%。本研究初步建立了可以同时高效、灵敏和特异检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,为人畜共患寄生虫的检测和监控提供了新方法。

液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒检测和分型中的应用

目的探究液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒（HPV）检测和分型中的应用。方法选取2011年5月至2013年4月该院妇科门诊就诊者宫颈脱落细胞500例,使用液相基因芯片技术对其进行HPV基因型检测。并对80例患者进行病理诊断,根据组织病理学将80例患者分为炎性反应组、细胞学正常组、宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组、CINⅡ组、CINⅠ～Ⅱ组、CINⅢ组。将病理诊断结果和HPV DNA亚型分布结果结合分析,对崇明地区宫颈病变程度和HPV感染基因型的关系进行分析。结果 500例标本中共180例HPV阳性患者,HPV总感染率为36%,共检出22种基因型,按照感染率从高到低依次为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染为85.96%,低危型感染为14.04%。500例标本中共180例HPV阳性患者,其中44例（24.44%）患者年龄为21～25岁的女性,11例（6.15%）患者年龄为51～67岁的女性,随着年龄的增大HPV阳性例数减少。随着宫颈病变级别的升高HPV感染率逐渐升高,两两比较结果显示,炎性反应组与正常组、CINⅢ组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅢ组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;其余11对两两对比差异具有统计学意义（P〈0.05）。随着宫颈病变级别的升高HPV多重感染率逐渐升高,但是仅炎性反应组与CINⅢ、CINⅡ组间差异有统计学意义（P〈0.05）。将组织病理学作为确诊标准,液相芯片HPV DNA检测CINⅢ、CINⅡ的特异度为76.63%,灵敏度为88.57%,阴性预测值为92.16%,阳性预测值为68.89%。结论崇明地区常见的HPV感染基因型为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV阳性多发于年轻女性,且HPV多重感染和感染率均随着宫颈病变的程度加重而加重。因而液相芯片HPV DNA检查对大规模筛查和宫颈病变的临床诊断有十分重要的价值。

牛白细胞黏附缺陷病液相基因芯片检测方法的建立

从福建某奶牛场200头进口荷斯坦牛采血提取牛血液DNA,根据已知牛染色体上CD18编码基因序列383位碱基由A变为G而引起牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)设计特异性野生型和突变型引物,建立液相基因芯片检测方法用于牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)的检测,结果检出2头母牛为BLAD携带者,检出率为0.67%,没有发现患病牛。结果证明建立的液相基因芯片检测方法是一种敏感性和特异性很高的筛选奶牛BLAD有害基因的新方法。

动物病原高通量检测技术

当前规模化养殖业迫切需要动物病原检测技术高通量化。高通量检测技术具有高通量、自动化、微量化等特点。病原高通量检测技术可分为高通量免疫学检测(检测抗原)和高通量分子生物学检测(检测核酸)两大类。论文对近年来报道的用于动物病原高通量检测的基因芯片技术、抗体芯片技术、液相芯片技术、流式细胞术多色荧光分析技术、变性高效液相色谱技术等新技术从原理、特点及应用等进行了综述。

液态芯片技术检测Y染色体微缺失方法的优化

目的优化基于液态芯片检测高通量、快检测Y染色体微缺失的方法。方法以sY84、sY86(AZFa),sY127、sY134(AZFb),sY152、sY153(AZFd),sY242、sY254、sY255(AZFc)等9个Y染色体微缺失的STS位点作为检测区域,以sY14(SRY,男性性别决定基因)位点作内部对照。优化探针引物组合,建立基于液态芯片的多重PCR-技术检测Y染色体微缺失的方法。结果优化的引物对在多重PCR体系中显示特异的扩增效率;多重PCR产物与STS特异的探针微球杂交后,在Luminex上显示非常强的特异性的荧光信号。结论多重PCR-液态芯片技术检测Y染色体微缺失的方法具有高灵敏性、高特异性,高准确性,操作简单,结果可靠,使快速、高通量筛选男性不育症的分子缺陷成为可能。

液相芯片和RT-PCR法在转移性肺癌EGFR突变检测中的比较

目的通过液相芯片法和RT-PCR法检测EGFR基因突变的一致性,探讨适用于临床转移性肺癌患者EGFR基因的突变检测法。方法收集47例转移性肺癌患者锁骨上肿物细针穿刺吸取物,经反复离心后取沉淀细胞行石蜡包埋,常规HE染色和免疫组化Multimer染色,利用液相芯片法和RT-PCR法检测EGFR基因19和21外显子的热点突变并进行分析。结果47例转移性肺癌患者中15例检测到EGFR基因突变,突变率为31.9%,其中6例为外显子19缺失突变,9例为外显子21点突变。两种方法对EGFR外显子19和21的基因突变检测结果完全一致。结论锁骨上吸取肿物可作为转移性肺腺癌患者EGFR基因突变的检测标本,且突变类型主要为外显子21点突变。液相芯片法和RT-PCR法均可作为转移性肺癌患者EGFR基因突变的检测法。

液相基因芯片法同时检测3种食源性病原菌

目的:建立一种能同时检测3种食源性病原菌的液相基因芯片方法。方法:针对金黄色葡萄球菌23SrDNA、志贺氏菌iapH、单核增生李斯特氏菌iap基因分别设计引物和探针,通过多重聚合酶链式反应扩增获得大小为246、112bp和174bp的目的片段;将探针偶联到编码微球上,制成基因芯片,与目的片段进行杂交,建立3种食源性病原菌的液相基因芯片方法;并评价该方法的特异性、灵敏度。结果:建立的液相基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高。对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌的检测灵敏度分别为38、44、21CFU/mL。结论:成功建立了3种致病菌的液相基因芯片检测方法。

液相芯片技术在地中海贫血基因诊断中的应用

目的探讨液相芯片技术在地中海贫血(以下简称地贫)基因诊断中的临床价值。方法收集南方医科大学附属小榄医院2017年1~6月已确诊的各类地贫基因型患者血液标本832份,采用液相芯片技术进行地贫基因检测;同时采用跨越断裂点PCR法(Gap-PCR)对α缺失型进行验证,采用PCR反点膜杂交法(PCR-RDB)对α和β突变型进行验证,并比较两种方法的检测结果;若两种检测方法结果不一致则用基因测序作最终验证。结果两种方法检测结果总符合率为99.199%,总Kappa值为0.982,液相芯片法出现黄区或灰区标注的结果,使用分析软件进行人工判读后,一致率达到100%。结论液相芯片技术能同时检测α地贫缺失型和α、β地贫突变型,适合大批量标本运作,具有极大的临床应用潜力。

男性不育患者Y染色体微缺失液态芯片筛查方法的建立及应用

目的建立一套全新的基因诊断方法,检测Y染色体无精子因子(azoospermia factor,AZF)区域微缺失,并对Y染色体微缺失与男性不育相关性进行初步探讨。方法按照欧洲男科协会和欧洲分子遗传实验质控网检测指南推荐标准,采用多重PCR-液态芯片技术对648例精子发生障碍的患者和100例合格捐精者进行Y染色体微缺失筛查。结果648例精子发生障碍的患者中,发现62例患者存在Y染色体AZF区域微缺失,对应于5种缺失模式AZFa,AZFb,AZFc,AZFb+c,AZFa+b+c。按区域统计,AZFc区域缺失的频率最高,其次是AZFb,AZFa的检出率最低。无精子症患者中微缺失的发生率为12．31％,严重少精子患者中微缺失发生率为5．43％。100例对照组没有发现任何缺失,两组比较,差异显著(P<0．001)。结论男性不育与Y染色体微缺失密切相关,本研究建立的多重PCR方法-液态芯片技术平台,用于男性不育患者的YqAZF区域筛查,结果可靠、快捷、重复性好、通量高。

HPV-DNA和TCT检测在宫颈癌前病变筛查中的临床价值

目的应用基因芯片HPV-DNA和液基薄层细胞学(TCT)方法筛查宫颈癌前病变及早期宫颈癌。方法对妇科门诊1076例患者行HPV-DNA和TCT筛查。对高危HPV阳性并且TCT≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)或者虽HPV检测结果阴性,但TCT为低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)及以上病变患者共224例,均经阴道镜下宫颈活组织检查或宫颈管诊刮,以病理结果作为最终诊断。结果 1076例患者中,高危HPV阳性检出率13.9%(150/1076),TCT检查者ASCUS阳性检出率15.2%(164/1076)。TCT和HPV均阳性者90例,8.4%(90/1076);2例宫颈浸润癌,CINⅠ～Ⅲ者为78例,诊断符合率占86.7%。结论 HPV-DNA联合TCT检测可提高宫颈癌前病变的诊断符合率。是高效、便捷的宫颈癌前病变的筛查方法 。

液态芯片监测铜绿假单胞菌多重耐药基因的研究

目的建立以液态芯片为检测手段的快速、高通量的铜绿假单胞菌多重耐药基因监测技术平台,探索建立能够常规应用于临床并解决现行临床表型测定局限性的分子生物学技术。方法针对铜绿假单胞菌中常见的OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因序列进行分析,依次对这8个耐药基因设计多重PCR扩增引物和序列特异的核酸探针,选取临床鉴定的含各耐药基因的耐药菌株作为阳性参比品进行检测工艺优化,进行铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台的研发。结果初步建立了铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台,组装了铜绿假单胞菌多重耐药检测液态芯片试剂盒1套。选择了8株含各耐药基因铜绿假单胞菌阳性菌株,用组装的试剂盒重复检测10次,耐药基因检测阳性率为100%,各耐药基因检测信号间无交叉,灵敏度﹑特异度以及重复性都很好。利用此平台进行了一定数量的临床标本检测分析。从检测结果来看,40份标本中,18份标本耐药基因阳性,其中含多耐药基因的标本有9份,占50%。18份阳性标本的耐药基因与耐药表型分析结果一致。结论此监测平台是将一种多重扩增技术和芯片技术-悬浮阵列技术相结合的方法,具有特异性高、可组合筛查、检测通量高的优势。

宜昌地区妇女人乳头瘤病毒感染特征分析

目的探讨宜昌地区健康体检女性26种人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的感染状况，并分析HPV不同亚型感染与不同宫颈病变的对应关系，同时为该地区HPV亚型的流行病学特点提供理论依据。方法选择2014—08—01—2014—10—13宜昌市中心人民医院1008例23～78岁健康体检女性，采集宫颈脱落细胞，通过基因芯片技术分析17种高危型和9种低危型HPV亚型的分布，同时配对进行液基细胞学检查。结果1008例妇女中，HPV阳性者232例（23．00％），总感染型为313例。26种HPV亚型感染率前5位的分别是HPVl6为14．06％（44／313），HPV58为12．46％（39／313），HPV52为9．27％（29／313），HPV54为7．35％（23／313），HPV51为6．71％（21／313）。〉30～35岁年龄段女性的HPV检出率为37．6％（44／117），与≤30岁（x2=7．770，P=0．005）、〉35～40岁（x2=7．682，P=0．006）、〉40～45岁（x2=14．909，PdO．001）、〉45～50岁（x2=7．996，P=0．005）和〉50岁（x2=8．875，P=0．003）比较，差异均有统计学意义；高危HPV感染率为31．6％（37／117），与≤30岁（x2=4．544，P=0．033）、〉35-40岁（x2=．857，P=0．003）、〉40～45岁（x2=11．976，P=0．001）、〉45～50岁（x2=5．843，P=0．016）和〉50岁（x2=7．504，P=0．006）比较，差异均有统计学意义；其中〉30-35岁年龄段女性的HPV检出率为37．6％（44／117），高危HPV感染率为31．6％（37／117），均最高，与其他不同年龄段人群分别比较，差异均有统计学意义，P〈O．05，符合流行病学特征。液基细胞学结果显示，HPV感染与宫颈上皮内病变密切相关。结论高危型HPV16、58和52型作为宜昌地区的优势型别，应纳入HPV疫苗研究重点。〉30-35岁妇女应列入宫颈癌前病变或子宫颈癌的重点筛查对象。

分支DNA-液相芯片技术在乳腺癌21基因检测中的应用分析

目的比对应用分支DNA-液相芯片技术和经典的OncotypeDx RT-PCR技术两种方法进行乳腺癌21基因检测结果的一致性,明确分支DNA-液相芯片技术可以作为临床常规检测的可行性方法,并结合乳腺癌的分子分型,预测患者的复发风险及化疗获益。方法选取64例河南省肿瘤医院2010—2011年间的原发乳腺癌luminal型患者,应用分支DNA-液相芯片技术和经典的OncotypeDx RT-PCR比对检测21基因mRNA表达量,根据检测结果计算出RS值(复发风险评分),分值为0~100分。RS<18分为低风险患者;18<RS<31为中风险患者;RS>31为高风险患者。结果 64例标本中,应用分支DNA-液相芯片技术和经典的OncotypeDx RTPCR比对检测21基因,二者结果一致性较高(93.8%);luminal A型病人,除1例外其余RS评分均小于18,全部为低复发风险,luminal B型病人,RS评分分布在6~56区间;luminal B型病人,内分泌治疗组的复发率为40%,内分泌加化疗组的复发率为6.7%。结论应用B-DNA-液相芯片技术在Luminex X200平台检测乳腺癌21基因与经典OncotypeDx RT-PCR比对一致性高,此技术可以进行临床推广应用;基于免疫组化方法的乳腺癌分子分型,与乳腺癌21基因检测得出的RS风险评分相结合,预测患者复发风险及化疗获益准确度高。

1型鸭甲肝病毒和鸭坦布苏病毒液相芯片抗体检测方法的建立

为建立1型鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virustype l，DHAV-1）和鸭坦布苏病毒（duck Tembusuvirus，DTMUV）抗体的液相芯片检测方法，应用RT-PCR从鸭尿囊液中扩增获得714bp的DHAV-1VPl序列和l503bp的DTMUVE序列，将其分别克隆至原核表达载体pCold Ⅲ和pET-28a（＋）并进行表达。通过SDS-PAGE验证DHAV1-VPl和DTMUVE蛋白能够有效表达，通过Westernblot进一步验证表达的蛋白均可与其对应的阳性血清发生反应。根据xMAP液相芯片技术原理，以表达的重组蛋白为抗原分别与不同编号的微球偶联，获得偶联复合体作为捕获载体，建立DHAV-1和DTMUV抗体单一和双重液相蛋白芯片检测方法。结果表明，DHAV-1和DT-MUV的临界值分别为190．30和223．29，灵敏性检测2种阳性血清的抗体水平分别为1：51200和1：6400，重复性验证批内和批间变异系数分别为1．44％和3．94％，为DHAV-1和DTMUV抗体监测提供了高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系。

液相芯片技术在检测致病相关基因中应用进展

液相芯片是一种重要的高通量分子检测技术,能够快速对一个样本进行多重检测和分析。该文综述了近年来液相芯片检测人类和模式动物的致病基因的应用,发现该技术能够对遗传性疾病、心血管疾病等致病相关基因及其在组织中的表达进行了定量检测,为临床诊疗和致病机制的研究提供了有力的支撑;还能够筛查实验动物的相关致病基因,以期为深入研究疾病与致病基因之间的关系,以及疾病动物模型的构建提供参考。

基因芯片法检测宁波地区结核分枝杆菌耐药性的研究

目的评价基因芯片法检测结核分枝杆菌(MTB)对利福平和异烟肼耐药性的效能。方法纳入痰液涂片阳性肺结核病患者278例,采用基因芯片法检测MTB对利福平和异烟肼的耐药性,对检测效能进行评价。结果基因芯片法检测涂阳肺结核患者利福平耐药性的灵敏度、特异度分别为68.18%、95.73%,与液体培养法差异无统计学意义(P>0.05),检测灵敏度随着涂阳等级差异无统计学意义(χ^(2)趋势=3.39,P=0.066)。检测异烟肼耐药性的灵敏度、特异度分别为45.45%、99.00%,与液体培养法差异有统计学意义(P<0.05),特别是≤3+涂阳等级的患者。检测耐多药的灵敏度、特异度分别为57.50%、97.48%,与液体培养法差异有统计学意义(χ^(2)=4.35,P=0.035)。结论基因芯片法检测涂阳肺结核患者利福平耐药性的真实性和可靠性较好,但对异烟肼耐药性和耐多药的效果不佳,特别是涂片阳性等级较低者容易发生漏检。