妊娠期感染LM的临床诊疗分析及其新生儿预后

目的探讨妊娠期感染产单核细胞李斯特菌(LM)的临床特点、诊疗分析及其新生儿预后。方法回顾性分析西安高新医院2013年9月至2017年9月诊治的妊娠期感染LM患者的临床特点、实验室检查、临床治疗和预后情况。结果共收治8例感染LM的孕妇,临床症状均不典型,2例诉腹痛,5例有上呼吸道感染症状,8例体温均有不同程度的升高,均引起胎儿宫内窘迫。实验室检查:白细胞总数、中性粒细胞百分比和C反应蛋白均有不同程度的升高;6例血培养和1例白带培养均检测到LM,1例通过脐血培养出LM。药敏结果显示,LM对青霉素、氨苄西林和复方新诺明敏感性均为100%,8例孕妇根据药敏结果及时调整用药,经治疗预后良好。8例产妇对应新生儿均为早发型感染,经血行感染5例、新生儿肺炎3例、化脓性脑膜炎2例、弥漫性血管内凝血(DIC)1例;患儿白细胞总数大部分正常,血小板部分降低,C反应蛋白和降钙素均升高,虽然确诊患儿也给予目标性治疗,但最终仅1例治愈。结论妊娠期感染LM的临床特点虽不典型,但对不明原因发热的孕妇,应及时送检血培养,并选择青霉素类药物进行经验性治疗,以降低新生儿感染率和死亡率。

单增李斯特菌食品分离株LM201的双组分信号转导系统的生物信息学分析

用生物信息学方法对已完成基因组测序的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)食品分离株LM201的双组分信号转导系统(Two-component signal transduction systems,TCSs)进行了数量统计、结构分析和功能预测。结果发现:LM201有14对TCSs和2个孤儿应答调控子(Response regulator,RR);其组氨酸激酶(Histidine kinase,HK)具有11种组成结构;其RRs分属于7个亚家族;有3对TCSs和1个孤儿RR的预测功能在Lm中未见报道,有1对TCS功能预测为未知。该研究结果能为构建Lm的TCSs交叉调控网络提供参考,以明确TCSs在Lm毒力调控方面的机制。

LIPI-3和LIPI-4共存对致病性单核细胞增生李斯特菌毒力的影响

【目的】探究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力岛3(LIPI-3)和LIPI-4共存对LM毒力的影响,揭示它们对细菌毒力的潜在调节作用,为进一步研究LM的致病机制提供依据。【方法】以LM928(存在LIPI-4)和LM873(同时存在LIPI-3和LIPI-4)2个LM菌株为研究对象,通过侵染HCMEC/D3细胞监测2种菌株对HCMEC/D3细胞的黏附和侵袭情况;通过鸡胚感染试验评估2株菌对鸡胚半数致死量(LD 50)的影响;采用溶血试验来测定菌株的溶血活性;通过流式细胞仪分析HCMEC/D3细胞凋亡情况,以评估菌株诱导细胞凋亡的能力;利用实时荧光定量PCR技术比较2株菌在BHI培养条件下及感染HCMEC/D3细胞后毒力基因的转录水平差异。【结果】LM928和LM873株的黏附率无显著差异(P>0.05),LM928株的侵袭率极显著高于LM873株(P<0.01)。LM873株的LD 50是LM928株的约1000倍;LM928和LM873株的溶血价分别为24和23。LM928株感染24和48 h后诱导的细胞凋亡率显著或极显著高于LM873株(P<0.05;P<0.01),而LM873株的凋亡率与对照组间无显著差异(P>0.05)。LM928和LM873株在BHI培养基中培养时,与LM928株相比,LM873株毒力基因mpl、inlB、inlC、inlP、actA、plcA、plcB和sigB的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因hly、inlA和iap的转录水平均极显著或显著下调(P<0.01;P<0.05)。LM928和LM873株侵染HCMEC/D3细胞后,与LM928株相比,LM873株毒力基因inlP、actA、plcA、plcB和prfA的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);毒力基因hly、mpl、inlA、inlB、inlC和iap的转录水平均极显著下调(P<0.01)。【结论】LIPI-3和LIPI-4共存降低了LM的毒力,该结果对进一步研究LIPI-3和LIPI-4在细菌毒力调控中的分子机制和复杂的相互作用具有重要意义。

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LMiap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。

单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是常见的食源性致病菌之一。目前,在众多单增李斯特菌的检测方法中应用较广的是免疫学检测法、分子学检测法。免疫学检测时间短,操作简单,但该方法依赖高特异性的抗体,会出现假阳性,还需要进一步鉴定检测结果。分子学检测法克服了免疫学检测法不能在种的水平鉴定单增李斯特菌的缺点,省时省力,灵敏度高,但是分子学检测法需要丰富的操作经验,并且不适于现场大批量检测。新兴的代谢学检测法、光谱学检测法、生物传感器等也都有各自的优缺点。本文综合近年最新文献,就单增李斯特菌检测的最新方法、检测进展及未来发展趋势予以分析综述,以期为该菌的检测提供参考。

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以106、107、108、109和1010CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD50;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD50剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD50为109.25CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础。

亚甲基蓝对单增李斯特菌菌膜的光动力杀伤作用

探讨单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物菌膜的生长特性及亚甲基蓝对LM生物菌膜光动力杀伤作用。通过结晶紫染色法判断与观察LM生物菌膜的形成并用酶标仪在595 nm波长处对其不同生长阶段的生物量进行测定,同时通过细菌平板菌落计数法研究亚甲基蓝对LM生物菌膜的光动力杀伤作用。结果表明:结晶紫染色法可用于定性判断与观察LM生物菌膜,且随着培养时间的延长,LM生物菌膜生物量不断增加,形成的网状结构越来越致密。当光敏剂质量浓度为10μg/mL的亚甲基蓝在光功密度为200 mW/cm2的可见光照射30 min时,即可使LM生物菌膜的失活率达到99.99%以上,其菌落数降低了4.08(lg(CFU/mL))。亚甲基蓝对LM生物菌膜的光动力灭活作用非常显著,其杀伤效果主要取决于光敏剂质量浓度和光照时间。

市售熟食单核细胞增生李斯特菌流行病学分析

目的了解市售散装熟食中Lm污染状况,探索Lm在熟食中流行特征,确定控制Lm的关键控制点。方法采集市售熟食、宾馆饭店熟食、生产熟食用原料、生产场所环境及用具、熟食销售场所环境及用具、宾馆饭店熟食间环境及用具样品共883份检测Lm,用统计学处理分析结果。结果市售散装熟食Lm检出率为13.06%,宾馆饭店熟食Lm检出率为1.02%,二者间有极显著差异(P<0.01)。生产原料Lm检出率为3.00%,生产环境及用具Lm检出率为22.22%。销售环境及用具Lm检出率11.02%,宾馆饭店熟食间环境及用具未检出Lm,二者间有显著差异(P<0.05)。结论市售熟食Lm与宾馆饭店熟食有极显著差异;销售环境及用具Lm与宾馆饭店熟食间环境及用具有显著差异。Lm关键控制点:建立相对封闭的销售环境,加强熟食冰箱、柜台内外、销售用具的消毒措施。

单核细胞增生性李斯特菌PCR快速检测方法的建立及在朝阳区大中型宾馆食品卫生监测中的应用

目的:通过扩增iap基因PCR法建立快速检测单核细胞增生性李斯特菌(Lm)方法。方法:用PCR法扩增iap基因来检测Lm标准菌株,并应用于朝阳区大中型宾馆的食品监测中。结果:将Lm、英诺克李斯特及其他13株非李斯特标准菌株同时进行PCR,仅Lm出现特异性条带,而其他菌株均未出现特异性片段,表明所扩增的iap基因约700 bp的DNA片段对Lm具有较高的特异性。PCR法对Lm纯培养物的检测限达106cfu/m l。采用该法对朝阳区大中型宾馆160件食品样品检测,5份样品呈阳性且均来源于B级餐厅,该结果与传统的生化鉴定方法完全一致。结论:扩增iap基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点,可用于食品Lm分离。朝阳区部分大中型宾馆的食品卫生监督仍有待加强。

单核细胞增多性李斯特菌LIPI-1全基因克隆与序列分析

参考GenBank中单核细胞增多性李斯特菌(LM)第I毒力岛(LIPI-1)有关基因序列设计引物,分段扩增、克隆了分离菌株XFL0605LIPI-1毒力岛全基因序列,序列全长8 558 bp,包括完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6个基因。对LIPI-1编码的6个毒力基因进行序列分析,各毒力基因反映的进化关系不尽一致,表明李斯特菌株在获得外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因来源也不尽相同。应用相应软件对各毒力基因编码蛋白的信号肽、跨膜区进行预测,确定了基因序列中调控蛋白PrfA结合区核苷酸序列。分析并确认了hlyA基因及推导氨基酸序列PEST基序和C端保守11肽序列。研究还发现LM菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105 bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有2个E/DFPPPPXD/E重复序列。

应用激光共聚焦显微镜观察光动力技术对单增李斯特菌菌膜的灭活作用

以亚甲基蓝(methylene blue,MB)为光敏剂,采用光催化专用氙灯光源(光功率密度为200mW/cm2),通过激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察法探讨了光动力杀菌技术(anti-microbial photodynamic technology,APDT)对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)菌膜(biofiLM,BF)的灭活作用。结果表明,MB-APDT处理的LM BF经过SYTO9/PI染色后在CLSM下观察,灭活效果区分明显。这一效果由平板菌落计数法得到进一步证实。光照20min,当MB的浓度低至0.1μg/mL时,APDT对于生长8h的BF失活率达到99.7%;当MB浓度为50μg/mL时,几乎全部LM BF失活。当MB浓度为1μg/mL时,光照5min即可使约99.6%生长8h的LM BF失活,也可使约78.7%生长36h的BF失活;当光照时间为30min时,生长8h LM-BF失活率达到99.97%,而生长36h BF失活率也达到99.94%。MB-APDT对LM BF的灭活效果主要取决于MB浓度和光照时间,且杀伤作用非常显著。

2007年成都市市售生猪肉中单核细胞增生李斯特菌污染调查

目的了解成都市市售生猪肉中单核细胞增生性李斯特菌的污染情况,为制订预防措施提供依据。方法采集农贸市场、超市售卖的生猪肉72份,按改良国标法分离鉴定。结果市售生猪肉中单核细胞增生李斯特菌的检出率达5.56%。结论成都市生猪肉中污染单核细胞增生李斯特菌状况不容忽视,食品卫生监督部门应加大卫生监督力度,预防控制李斯特菌食物中毒发生。

显色底物大豆磷脂酰肌醇的分离纯化与检测方法研究进展

综述了大豆磷脂酰肌醇的分离纯化与检测方法研究进展,并介绍了其在单核细胞增生性李斯特菌显色培养基方面的应用,指出了该领域存在的问题和今后的研究方向。

单增李斯特氏菌快速鉴定技术的研究

目的：建立单增李斯特氏菌快速鉴定技术；方法：选择Hly、Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增；结果：单增李斯特氏菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特氏菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病茵及非增李斯特氏茵均不见扩增条带．52株李斯特氏菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%(P＞0.5；X2=0.5)．结论：本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感性强、特异性高的单增李斯特氏菌鉴定方法．

单核细胞增生性李斯特菌PCR快速检测方法建立及应用

目的 通过扩增hly基因PCR法建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌 (Lm )方法。 方法 :用PCR法扩增hly基因来检测标准菌株及临床分离的Lm的纯培养物和模拟污染的生猪肉、水和牛奶 ,并应用于实际食品检验工作中进行验证。结果 34株Lm的PCR结果呈阳性 ,而其它李斯特菌 ,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性的片段。表明所扩增的hly基因 3’末段 82 7bp的DNA片段对Lm具有较高的特异性。PCR法对Lm纯培养物的检测限达 10 5CFU/ml,对模拟污染生猪肉、水和牛奶的 30℃ 16h改良LEB增菌培养液用PCR法检测 ,结果检测限达 10CFU/ 2 5 g(ml)。进一步研究表明该PCR扩增体系能检测出 6 .5pg的LmDNA ,整个检测过程只需 2 4h。采用该法对扬州市区 16 9份食品样品检测 ,8份样品Lm呈阳性且结果与传统的生化鉴定方法完全一致。结论 扩增hly基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点 。

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。

NLRP3炎症小体介导单核细胞增生李斯特菌感染小鼠和巨噬细胞的细胞焦亡

目的:探讨单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)感染引起小鼠和巨噬细胞的细胞焦亡作用机制。方法:体内实验,C57B/6小鼠分为Lm组和阴性对照组(NC组),分别经小鼠尾静脉注射Lm菌液5×104 CFU/鼠和无菌PBS,24 h后取脾脏、肝脏、脑组织,蛋白质印迹法检测焦亡及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体相关蛋白的表达。体外实验,分Lm组、NC组、LPS+ATP组、Lm+MCC950组和LPS+ATP+MCC950组。以感染复数(multiplicity of infection,MOI)=10 Lm感染THP-1源巨噬细胞,ELISA检测细胞上清液IL-1β,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞焦亡及NLRP3炎症小体mRNA和蛋白的表达,免疫荧光检测Lm感染后凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)斑点及与NLRP3的共定位。结果:Lm感染小鼠和巨噬细胞后,消化道皮肤素D(gasdermin D,GSDMD)蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),且出现GSDMD蛋白氨基端裂解片段(gasdermin D N-terminal,GSDMD-NT)。Lm感染巨噬细胞1 h、3 h、6 h,NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA水平均明显升高(P<0.05),且3 h升高最明显。Lm感染小鼠的脾、肝、脑组织NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β及裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17蛋白表达量均明显升高(P<0.05)。Lm感染巨噬细胞后IL-1β分泌水平升高,细胞上清液中检测到裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17的分泌,细胞裂解液中NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达升高(P<0.05),荧光显微镜观察到ASC斑点形成且与NLRP3蛋白存在共定位。加入NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理后,巨噬细胞GSDMD-NT明显减少(P<0.05)。结论:Lm感染导致的细胞焦亡主要与NLRP3炎症小体的激活有关。

融合魏斯氏菌对单增李斯特菌生物膜形成的影响

从东北传统酸菜的12株乳酸菌中筛选对单增李斯特菌有较强拮抗作用的低温生长菌株,并分析其对单增李斯特菌生物膜形成的影响。首先测定乳酸菌菌株的低温生长特征和抑菌活性;然后采用定性法和定量法分析乳酸菌菌株对单核细胞增生李斯特菌生物膜形成和形态结构的影响;最终通过生理生化和16S rDNA测序对乳酸菌菌株进行鉴定。结果表明:菌株Z01在10℃低温下生长,培养72 h后OD595 nm值增加0.23,且具有抗单增李斯特菌活性,抑菌圈直径达19.79 mm。菌株Z01粗提物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为16.0 mg/mL,当粗提物浓度为0.5 MIC和1.0 MIC时,对生物膜形成抑制率分别为59.33%和77.77%,对生物膜黏附细菌的抑制率分别为14.49%和26.44%。该菌株被鉴定为融合魏斯氏菌(Weissella confusa),为研发在低温条件控制单核细胞增生李斯特菌的生物制剂奠定基础。

妊娠期单核细胞增生李斯特菌感染孕妇的饮食习惯及临床分析

目的探讨妊娠期单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes,LM)感染孕妇的饮食习惯及临床特征。方法选取2017年10月至2022年9月北京妇产医院妊娠期LM感染的孕妇10例,分析其感染前4周的饮食及卫生习惯、临床特征及妊娠结局、新生儿预后等。结果10例孕妇中,孕中期LM感染7例、孕晚期3例。10例孕妇经治疗后LM感染均痊愈,其中6例孕妇出现流产及胎死宫内。10例孕妇在感染前4周内均有不同程度食用生冷食物或不洁饮食史,以生食水果、熟肉制品及外出就餐情况为主;存在冰箱清理不及时及生熟食品砧板未分开使用等饮食不良卫生习惯问题。结论妊娠期感染LM不良后果较重,应关注相应症状孕妇的饮食史、加强孕产期健康宣教、避免食用不洁饮食,改善饮食卫生习惯,避免妊娠期感染LM的发生。

基于主成分分析的食源性致病菌的投影判别分析

目的:以大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌为研究对象,建立近红外光谱检测食源性致病菌的方法。方法:利用近红外光谱分析技术,对大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的细胞壁、细胞质和全细胞分别进行基于主成分分析的投影判别分析。结果:多元散射校正法对光谱预处理比矢量归一法预处理后的细胞质壁分离更为有效;采用细胞壁进行判别比用细胞质判别3种致病菌的结果好;G阴性菌与G阳性菌之间的判别比同性菌之间判别准确度高,对细胞壁的分辨率达到100%。结论:利用基于近红外光谱主成分分析的投影判别分析技术,可以检测和鉴别上述3种致病菌,且其分辨率为100%。