苦参碱对油酸诱导的脂肪变性Chang Liver细胞的影响及机制

目的探讨苦参碱对油酸诱导的脂肪变性Chang Liver细胞的改善作用及可能的机制。方法将Chang Liver细胞分为空白组、模型组和苦参碱低、中、高浓度组(0.1、0.5、1.0 mmol/L)。除空白组外,其余各组细胞使用1.0 mmol/L油酸处理24 h建立脂肪变性细胞模型,苦参碱各剂量组加入相应浓度药物干预24 h。检测细胞活性,观察细胞内脂滴形态,测定细胞中的脂质含量,检测细胞中肝功能指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)]含量和法尼醇X受体(FXR)、细胞色素P4507A1(CYP7A1)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)的mRNA及蛋白表达水平。结果油酸和苦参碱对Chang Liver细胞活性无明显影响。经油酸处理后的细胞内可见橘红色脂滴;与空白组比较,其相对脂质含量、肝功能指标水平均显著升高,FXR、CYP7A1、FGF19 mRNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。经低、中、高浓度苦参碱干预后,上述指标均显著逆转(P<0.05)。结论苦参碱可通过调控FXR/CYP7A1/FGF19信号通路来改善油酸诱导的脂肪变性Chang Liver细胞的脂质含量和肝功能指标。

亚砷酸钠致Chang liver细胞氧化应激作用的研究

目的研究不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人肝细胞株Chang liver的氧化应激作用。方法采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测NaAsO2(0、0.1、1、5、10、20、30、50、80、100、200μmol/L)对Chang liver细胞活力的影响,利用2’,7’-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)水平,利用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸比色法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量。结果与对照组比较,0.1μmol/LNaAsO2组细胞活力显著增强(P<0.05);10～200μmol/LNaAsO2浓度范围内,细胞活力随NaAsO2浓度升高而下降(P<0.05)。在0～30μmol/LNaAsO2浓度范围内,随着NaAsO2浓度的增高,细胞内ROS水平升高(P<0.05),SOD活力降低(P<0.001),MDA含量升高(P<0.001)。结论氧化应激可能是NaAsO2对Chang liver细胞毒性作用的机制之一。

银杏叶提取物及其黄酮类单体对ChangLiver细胞中CYP3A4和CYP2C9的影响

目的研究银杏叶提取物(GBE)及其黄酮类单体槲皮素和山柰酚对Chang Liver细胞CYP3A4、CYP2C9表达的影响。方法 CCK-8法检测GBE、槲皮素、山柰酚对Chang Liver细胞增殖的抑制作用;RT-PCR方法检测其不同浓度对Chang Liver细胞中CYP3A4 mRNA、CYP2C9 mRNA表达的影响;Western blot方法测定CYP3A4、CYP2C9蛋白表达的相对含量。结果 GBE呈浓度依赖性地诱导CYP3A4 mRNA和蛋白的表达,对CYP2C9mRNA和蛋白的表达没有显著作用;槲皮素对CYP3A4 mRNA和蛋白的表达有较明显的诱导作用,呈浓度依赖性地抑制CYP2C9 mRNA和蛋白的表达;山柰酚呈浓度依赖性地抑制细胞中CYP3A4 mRNA和蛋白的表达,对CYP2C9 mRNA和蛋白的表达没有显著影响。结论 GBE、槲皮素、山柰酚对Chang Liver细胞中CYP3A4、CYP2C9的表达具有不同的影响作用,这些结果为GBE与其他药物相互作用提供理论基础,提高联合用药的有效性及安全性,为黄酮类单体新药开发提供参考信息和理论依据。

穿心莲内酯及其类似物对Chang Liver细胞中CDKs的影响

目的:探究穿心莲内酯及类似物对Chang Liver细胞活力的影响和机制。方法:CCK-8法检测穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对Chang Liver细胞活力的影响;Q-PCR和Western blot法分别检测药物不同浓度对Chang Liver细胞中CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA和蛋白表达的影响。结果:穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯呈浓度依赖性地抑制细胞增殖,新穿心莲内酯对细胞增殖无影响;脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在药物达到一定剂量时均可抑制CDK4与CDK6 mRNA水平的表达;穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯在100μmol/L时,均可抑制CDK4与CDK6蛋白水平的表达;新穿心莲内酯对CDKs的抑制不明显。结论:穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对细胞增殖的抑制作用与对CDK4、CDK6的调节密切相关。

灯盏乙素对Chang Liver细胞中CYP2C9的影响

目的:探讨灯盏乙素对Chang Liver细胞中CYP2C9表达的影响。方法:采用MTT(噻唑蓝)法检测灯盏乙素对Chang Liver细胞增殖活力的影响,采用RT-PCR和Western-blot法分别检测细胞中CYP2C9 mRNA和蛋白的相对表达量。结果:灯盏乙素对Chang Liver细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性,半数抑制率(IC50)为1.87 mmol/L。RT-PCR结果表明,与DMSO(二甲基亚砜)组比,药物浓度为5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L时,细胞CYP2C9 mRNA表达量显著下降(P<0.05)。Western-blot结果表明,与DMSO组比较,药物浓度为20.0、40.0μmol/L时细胞CYP2C9蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论:灯盏乙素对Chang Liver细胞中CYP2C9 mRNA和蛋白的表达有不同程度的抑制作用。

黄芪甲苷对Chang Liver细胞酒精性和非酒精性氧化损伤的保护作用

目的:探讨黄芪甲苷对Chang Liver细胞酒精性和非酒精性氧化损伤的保护作用。方法:以Chang Liver细胞为研究对象,使用乙醇、H2O2分别建立酒精性及非酒精性氧化损伤模型,MTT法测定细胞存活率,微板法、比色法检测转氨酶活力及抗氧化能力,DCF荧光法检测细胞内活性氧,流式细胞术检测细胞周期,DNA ladder法检测细胞凋亡。结果:2种氧化损伤均可导致Chang Liver细胞存活率和抗氧化酶活性下降、以及细胞外液中转氨酶活力和丙二醛含量升高,黄芪甲苷对上述损伤均有显著或极显著的保护效果;同时,乙醇能够显著降低损伤细胞内的活性氧水平,而H2O2能够显著升高损伤细胞内的活性氧水平,黄芪甲苷则能使上述异常的活性氧水平趋于正常。同时缓解乙醇或H2O2对Chang Liver细胞G0/G1期的阻滞现象,并对二者诱导的细胞凋亡均有一定的抑制作用。结论:黄芪甲苷对Chang Liver细胞的酒精性和非酒精性氧化损伤均有保护作用。

黄芪3种成分对Chang Liver细胞氧化应激的抑制作用

本研究主要在于探讨黄芪3种成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素)对H2O2诱导Chang Liver细胞氧化应激的影响。以人正常肝实质细胞Chang Liver细胞为研究对象,同时选取具有明确保肝作用的联苯双酯为阳性对照药物,通过H2O2诱导氧化应激建立损伤模型进行实验。设立空白对照组、氧化应激组、黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮葡萄糖苷组、芒柄花素组、阳性对照组。通过微板法、比色法检测内源性抗氧化体系相关指标,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平,分光光度法、Real-time PCR法、Western blot法分别检测细胞肝微粒体CYP2E1的活性及其mRNA和蛋白的表达变化。从实验结果中可以看出,H2O2的诱导使Chang Liver细胞抗氧化能力降低,细胞内活性氧水平及CYP2E1表达的升高,而3种黄芪成分对细胞的预处理均可显著或极显著的改变上述氧化应激状态(与氧化应激组比,P<0.05,P<0.01),总体效果与阳性对照组药物联苯双酯作用相当。由此表明,3种黄芪成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素)对H2O2诱导所致Chang Liver细胞氧化应激均有显著或极显著的抑制作用,细胞的氧化损伤得到明显缓解。

叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致Chang liver细胞毒性的影响

目的探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO2)致Changliver细胞毒性的影响。方法Changliver细胞培养48h后分别以20、40、60和80μmol/L的NaAsO2染毒24和48h,作为NaAsO2单独作用组。以5和20μmol/L的tBHQ预处理Chang liver细胞24h,以40和60μmol/L的NaAsO2染毒24和48h,作为tBHQ预处理组;对照组处理同NaAsO2单独作用组。每个浓度设3个复孔。用Alamar Blue法检测细胞活力。结果NaAsO2单独作用24和48h组Alamar Blue还原率显著下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);且NaAsO2单独作用48h组的Alamar Blue还原率均显著低于24h组,差异有统计学意义(P<0.01)。5μmol/L的tBHQ预处理组与对应的60μmol/LNaAsO2单独作用24h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P<0.01);20μmol/L的tBHQ预处理组的AlamarBlue还原率均显著高于相对应NaAsO2单独作用24h组(P<0.05)。5μmol/L的tBHQ预处理组的Alamar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO2单独作用48h组(P<0.01);20μmol/L的tBHQ预处理组与对应的40μmol/LNaAsO2单独作用48h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P<0.01)。结论tBHQ能够降低NaAsO2致Changliver细胞的毒性,增强细胞对NaAsO2毒性的抵抗能力。

黄芪3种成分对H_2O_2诱导Chang liver细胞凋亡的抑制作用

以H2O2建立Chang liver细胞损伤模型,设空白对照组、损伤模型组、黄芪甲苷保护组、毛蕊异黄酮葡糖苷保护组、芒柄花素保护组和阳性对照组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、微板法、流式细胞术、DNA Ladder检测等方法测定细胞存活率、细胞外液转氨酶活性、周期分布及凋亡情况。结果显示H2O2的诱导使Chang liver细胞存活率降低、活性升高、发生G0/G1期阻滞及细胞外液转氨酶、细胞凋亡率的升高,3种成分对细胞的预处理均可显著或极显著的升高细胞存活率、缓解G0/G1期的阻滞现象、并降低细胞外液转氨酶活性及细胞凋亡率(P<0.05或P<0.01)。表明黄芪主要成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡糖苷和芒柄花素)对H2O2诱导的Chang liver细胞凋亡均有一定的抑制作用。

无机砷对Chang liver细胞血红素单加氧酶-1表达的活化作用

目的观察无机砷（NaAsO2）对正常人肝细胞株Changliver细胞血红素单加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）表达的活化作用。方法采用细胞培养的方法，将Changliver细胞分别暴露于10μm01／LNaAsO：后0（对照）、2、6、12、24h和0（对照）、5、10、25、50μmol／L后12h，收集细胞，Westernblot技术检测细胞内HO-1蛋白的表达。结果Changliver细胞染砷10μmol／L，体外培养6、12、24h，细胞内HO-1蛋白表达（3．97±0．72、12．92±2．98、23．29±3．82）明显高于对照组（1．00±0．00），组间比较和各组分别与对照组比较，差异有统计学意义（F=85．83，P〈0．01；￡值分别为-9．42、-8．95、-13．83，P〈0．05或〈0．01）。染砷5、10、25、50μmol／L．体外培养12h，细胞内HO-1蛋白表达（6．34±0．25、7．75±0．39、7．93±0．14、12，48±0．35）明显高于对照组（1．00±0．00），组间比较和各组分别与对照组比较，差异有统计学意义（F=709．66，P〈0．01；t值分别为-36．25、-30．19、-86．40、-56．40，P〈0．01）。结论无机砷能够诱导ChangLiver细胞内HO-1的活化，促进蛋白表达，并且具有时间和剂量效应。

慢病毒-HBx表达载体的构建及其在人正常肝细胞系Chang liver的稳定表达

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus x,HBx)慢病毒表达载体,建立稳定表达HBx蛋白的人正常肝细胞系Chang liverHBx.方法:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法从质粒中扩增HBx基因,并克隆到慢病毒p EB-3xflag-GP-Puro载体上,经PCR、酶切和测序鉴定正确后经慢病毒包装感染人肝细胞Chang liver,再用嘌呤霉素筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株,最后用免疫荧光和Western blot技术检测HBx蛋白的表达.结果:酶切鉴定和基因测序证实HBx基因成功克隆到慢病毒表达载体上,重组慢病毒经包装纯化后获得滴度为1×108 TU/m L,用包装好的重组慢病毒感染人肝细胞Chang liver,经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株Chang liver-HBx,利用免疫荧光和Western blot技术检测发现细胞株Chang liver-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBx的重组慢病毒表达载体,获得了稳定表达HBx的Chang liver细胞系Chang liver-HBx,为进一步研究HBx诱导正常肝细胞恶性转化提供细胞模型.

LPS致肝细胞损伤模型的建立研究

[目的]探索LPS体外致人Chang Liver细胞损伤模型的建立方法和意义。[方法]分别用20、40、60、80、100μg/ml浓度的LPS作用Chang Liver细胞24 h,采用MTT法检测LPS对Chang Liver细胞存活率的影响,分别测定Chang Liver细胞上清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性,并通过Hoechst 33258荧光染色观察用药24 h后Chang Liver细胞形态的变化。[结果]80和100μg/ml浓度的LPS作用后Chang Liver细胞存活率显著性降低,胞外AST、ALT、ALP、γ-GT、LDH酶活性升高,细胞数目减少,细胞形态发生改变,呈现细胞核固缩等细胞凋亡现象。[结论]用80μg/ml的LPS与Chang Liver细胞共培养24 h,可以建立理想的体外肝细胞损伤模型。

槲皮素对肝细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨槲皮素对氧化应激Chang liver细胞损伤的保护作用及其作用的分子机制。方法培养Chang liver细胞,将细胞随机分为正常对照组、H2O2组及槲皮素低、中、高剂量组。MTT法检测肝细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率。2′,7′-二氯荧光素乙二酯(DCFH-DA)细胞内活性氧(ROS)荧光染色后,荧光显微镜观察照相及流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。试剂盒测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及细胞中丙二醛(MDA)的含量。采用Western blot法检测Nrf2蛋白的表达。结果 H2O2组较正常对照组细胞存活率、SOD、GSH-Px、CAT活性降低(P<0.05),凋亡率、平均荧光强度(MFI)及MDA升高(P<0.05)。不同剂量槲皮素组细胞存活率及细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性高于H2O2组(P<0.05),MDA、凋亡率、MFI水平低于H2O2组(P<0.05)。槲皮素低、中及高剂量组Nrf2蛋白均高于H2O2组(P<0.05)。结论槲皮素对氧化应激肝细胞损伤具有保护作用,其机制可能与激活Nrf2-ARE通路,进而增强下游抗氧化基因的表达有关。

三七总皂苷对细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C9的影响

目的探讨三七总皂苷对Chang Liver细胞P450酶(CYP450) CYP3A4和CYP2C9表达的影响。方法采用CCK-8法考察三七总皂苷对Chang Liver细胞活力的影响,确定给药剂量范围;采用定量RT-PCR法考察三七总皂苷在给药后4,8,24,48 h对Chang Liver细胞中CYP3A4和CYP2C9 mRNA表达的影响;通过蛋白质印迹(Western Blot)法考察三七总皂苷在给药后4,8,24,48 h对Chang Liver细胞中CYP3A4和CYP2C9蛋白表达的影响。结果 100μg/m L三七总皂苷干预Chang Liver细胞4,8,24,48 h后,各干预组CYP2C9蛋白表达量明显高于空白对照组(P <0. 05),各组诱导水平随着作用时间的延长相应增加。8 h组、24 h组、48 h组CYP3A4蛋白表达量明显高于空白对照组(P <0. 05),各组的相对蛋白表达量呈时间依赖性,8 h组、24 h组、48 h组CYP2C9和CYP3A4的mRNA表达量均明显高于空白对照组(P <0. 05),且各组的诱导水平随着作用时间的延长相应增加。结论三七总皂苷可诱导CYP3A4和CYP2C9的mRNA及蛋白的表达,临床在使用三七总皂苷时,需要关注其与CYP3A4和CYP2C9底物药物之间可能的相互作用。

穿心莲片对华法林药代动力学的影响及机制研究

目的研究穿心莲片对华法林药代动力学的影响,以及穿心莲有效成分穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对Chang Liver细胞CYP3A4和CYP2C9表达的影响,并探索穿心莲片影响华法林代谢的机制。方法采用HPLC-MS/MS检测穿心莲片对华法林药代动力学的影响;RT-PCR法和Western blot法分别检测穿心莲有效成分对Chang Liver细胞中CYP3A4、CYP2C9 mRNA和蛋白表达的影响。结果在SD大鼠体内,穿心莲片可抑制华法林的代谢,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和新穿心莲内酯可降低CYP3A4、CYP2C9 mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论穿心莲和华法林联合用药的药代动力学研究结果发现,穿心莲片能够抑制华法林在大鼠体内的代谢,这可能与穿心莲成分穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯和新穿心莲内酯降低CYP3A4及CYP2C9酶的表达有关。

喹烯酮和喹乙醇对人源肝细胞的毒性作用

采用Chang Liver和L-02 2株人源肝细胞为生物材料,通过细胞生长抑制试验、DNA损伤分析、兴奋性试验,观测喹烯酮和喹乙醇不同作用剂量和作用时间下对细胞生长的影响,对细胞DNA尾长、尾部DNA百分含量和Oliver尾距的影响以及低剂量药物对细胞兴奋效应的诱导作用,并进行统计分析。结果显示,高剂量喹烯酮和喹乙醇对Chang Liver细胞作用24 h的最高抑制率分别达73.29%和31.88%,对L-02细胞作用24 h的最高抑制率分别达76.51%和39.7%,且抑制作用呈剂量和时间相关性,但低剂量喹烯酮也能诱导L-02细胞产生兴奋效应(P<0.01);同时,细胞DNA尾长、尾部DNA百分含量和Oliver尾距随药物剂量的增加而不断上升,证明2种药还可显著诱导这2株细胞的DNA损伤(P<0.01),且喹乙醇导致的损伤比喹烯酮严重。结果表明,喹烯酮和喹乙醇对人肝细胞均具有一定的毒性,但喹烯酮的毒性作用比喹乙醇小。

文蛤多肽的制备及对非酒精性脂肪肝细胞模型的修复作用

目的:探讨文蛤酶解多肽的制备工艺及对非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞模型的修复作用。方法:用质量浓度15μg/m L的软脂酸诱导正常肝Chang liver细胞建立NAFLD模型,以TG含量为指标,筛选酶解文蛤内脏的最佳酶种,通过正交试验、超滤、G-25葡聚糖凝胶层析、高效液相等技术获得酶解产物。将其作用于NAFLD细胞模型,油红O染色后镜下观察形态,检测细胞中的MDA,GSH-ST,ALT,AST,SOD,γ-GT等含量。结果:软脂酸诱导Chang liver细胞48 h后获得NAFLD细胞模型;最佳酶种为碱性蛋白酶,酶解条件为40℃、pH9.5、料液比1∶2、酶解时间12 h,加酶量1 000 U/g;超滤后得到<5 ku酶解液,经G-25葡聚糖凝胶层析得到4个峰;峰Ⅰ组分的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp。该多肽能明显降低NAFLD细胞模型内的TG含量,使MDA,ALT,AST,γ-GT的含量下降,SOD,GSH-ST的含量上升,与未用药的模型组细胞相比有统计学意义。结论 :经碱性蛋白酶酶解文蛤得到的多肽,对NAFLD细胞模型具有明显的修复作用。

糖类相关基因芯片的设计与制备

随着糖组学的发展,研究表明某些疾病如肿瘤等的发生伴随着体内糖蛋白表面糖链结构的变化,而糖链结构的形成与修饰经过糖基转移酶、糖苷酶和磺基转移酶的参与.本研究从Genebank等数据库中选取人类糖基转移酶基因127条、糖苷酶基因34条和磺基转移酶34条以及管家基因10条.通过对每个基因的mRNA序列进行探针设计,制备出一款糖类相关基因芯片,用于研究糖类相关基因的表达谱,旨在揭示疾病发生与糖类相关基因表达变化的关联性.制备的芯片应用于人肝癌细胞系SMMC-7721与正常肝细胞系Chang’s liver的研究,筛选出差异表达的基因34个,其中上调基因19个、下调基因15个.通过对2个上调基因和2个下调基因进行Realtime-PCR验证,得到了一致的实验结果.