竹盐酿造酱油对H_2O_2诱发LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用

目的:研究竹盐酿造酱油乙醇提取物对H2O2诱发猪肾近曲上皮小管细胞(pig proximal tubular cell)LLC-PK1氧化损伤的保护作用。方法:以不同质量浓度(10~200μg/m L)的竹盐酿造酱油乙醇提取物预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500μmol/L H2O2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。结果:经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少,ROS水平显著降低。同时,细胞内抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)的活性及其m RNA转录水平,GSH含量也较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞增加。结论:竹盐酿造酱油乙醇提取物可以通过提高细胞内抗氧化酶系的活性和抗氧化物质GSH的含量而有效地对抗H2O2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。

庆大霉素诱导LLC-PK1细胞凋亡与p27^(Kip1)表达关系的研究

目的 观察庆大霉素对体外培养的肾小管上皮细胞凋亡的诱导作用 ;研究细胞周期调节蛋白 p2 7Kip1蛋白和mRNA表达在凋亡过程中的变化 ;并探讨细胞凋亡与p2 7Kip1之间的关系。方法 对体外培养的猪肾近端小管上皮细胞株 (LLC PK1细胞 )予以不同浓度的庆大霉素溶液分别作用 2 4～ 96h ,以MTT法测定庆大霉素对LLC PK1细胞增殖的抑制率 ,抽提细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡条带 ,流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞增殖动力学 ,WesternBlot法检测细胞内p2 7Kip1的蛋白表达 ,RT PCR法检测细胞p2 7Kip1mRNA表达的变化。结果 庆大霉素对LLC PK1细胞增殖有抑制作用 ,具诱导LLC PK1细胞凋亡的作用 ,凋亡率呈药物浓度和作用时间依赖性 ;庆大霉素致细胞周期停滞于G1期。p2 7Kip1蛋白在细胞内的表达随着干预的庆大霉素浓度增加而逐渐上调 ,蛋白水平与凋亡率之间呈正相关 ,其mRNA表达趋势与其蛋白表达一致。结论 庆大霉素诱导的LLC PK1细胞凋亡与细胞周期蛋白p2 7Kip1表达密切相关。

人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用

目的:探讨人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用。方法:通过基于细胞的肾脏保护试验,研究了发酵黑参(FBG)及其活性成分人参皂苷20(S)-Rg3对猪肾(LLC-PK1)细胞中顺铂(化疗药物)诱导的损伤的保护作用。结果:由顺铂诱导的细胞活力降低,再使用FBG提取物和人参皂苷20(S)-Rg3依赖剂量后明显恢复。用FBG提取物或人参皂苷20(S)-Rg3处理后会降低顺铂诱导升高与磷酸化c-Jun N-末端激酶(JNK),p53和裂解的半胱天冬酶-3升高的蛋白。通过用FBG和人参皂苷20(S)-Rg3的共同处理,由于顺铂的诱导导致凋亡LLC-PK1细胞升高的百分比显著降低。结论:人参皂苷20(s)-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性,人参皂苷20(S)-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分。

低渗培养对LLC-PK1细胞pICln蛋白分布的影响

目的探讨低渗条件下LLC-PK1细胞pIC ln蛋白的分布变化。方法分别用等渗和50%低渗培养基对LLC-PK1细胞进行培养,用抗pIC ln血清抗体对细胞可溶性和不溶性成分的pIC ln进行W estern b lot检测,同时进行细胞的荧光抗体染色。结果W estern b lot显示等渗培养时LLC-PK1细胞可溶性成分中pIC ln免疫反应带的密度为(51±3)%;50%低渗培养时明显增多到(69±3)%,两者比较有统计学意义(P<0.01)。荧光抗体染色也显示了pIC ln在胞质中明显增多。结论pIC ln对低渗是敏感的,它可能作为胞质调节蛋白、低渗时在胞质中分布增多能促进胞内渗透性物质的运出,参与调节细胞体积而对抗低渗。

韩国产芝麻酱油对AAPH诱发LLC-PK1细胞氧化应激的保护作用

以芝麻酿造酱油乙醇提取物(ethanol extract sesame sauce,SSE)为研究对象,探讨其对1 mmol/L 2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH)引发的LLC-PK1猪肾近曲小管上皮细胞氧化应激损伤的保护作用。方法:LLC-PK1细胞与不同质量浓度(10~100μg/m L)的SSE预先共同培养24 h后,用含AAPH的DMEM培养液继续培养4 h建立细胞损伤模型。细胞存活率用四甲基偶氮唑蓝法检测,细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和总活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平分别以硫代巴比妥酸比色法和2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠探针法测定。细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)活力和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量按试剂盒说明书以比色法测定。结果表明,SSE预处理可以提高受损细胞存活率,降低细胞内总ROS水平和MDA含量。同时,SSE还能提高受损细胞内抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)及γ-GCS活力并提高细胞内GSH含量。实时荧光定量聚合酶链式反应分析也提示SSE能上调细胞内抗氧化物酶(CAT、SOD和GSH-Px)的m RNA表达量。此外,SSE可以通过提高细胞内源性抗氧化系统能力来降低细胞内MDA和ROS水平,并由此缓解AAPH对LLC-PK1细胞所造成的氧化应激损伤。

茯砖茶对H_2O_2诱发LLC-PK1细胞损伤的保护作用

探讨茯砖茶乙醇提取物(FTE)对H2O2诱发猪肾近曲小管LLC-PK1上皮细胞氧化损伤的保护作用。以不同质量浓度(10～200μg/mL)的FTE预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500μmol/L H2O2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。MTT法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT),超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)含量。经不同浓度FTE预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少。同时,细胞内主要抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-px)含量也较对照组增加,并呈剂量效应关系。结果提示,预先经FTE的保护可有效地对抗H2O2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。

马兜铃酸I诱导的LLC-PK1细胞凋亡及其意义

目的探讨在体外条件下马兜铃酸Ｉ（ＡＡＩ）能否诱导肾小管上皮细胞发生凋亡及发生凋亡的条件。方法应用光镜、琼脂糖凝胶电泳、ＡｎｎｅｘｉｎＶＦｌｏｕｓ凋亡检测试剂盒鉴定细胞凋亡，应用流式细胞仪测定凋亡细胞比例。结果００２ｇ／Ｌ，００４ｇ／Ｌ，００８ｇ／Ｌ的ＡＡＩ作用２４小时可明显诱导ＬＬＣＰＫ１细胞凋亡，００１ｇ／Ｌ的ＡＡＩ无此作用。随ＡＡＩ浓度的增高，凋亡细胞比例增加。结论在体外条件下一定浓度的ＡＡＩ能诱导ＬＬＣＰＫ１细胞发生凋亡，其作用与浓度有关。

镉诱导LLC-PK_1细胞凋亡对基因表达的影响

目的探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡对bcl-2、p53(mtp53)、c-mycc、-fos与ras基因表达的影响。方法采用流式细胞仪分别测定bcl-2、p53、c-myc、c-fos与ras基因表达产物。结果不同浓度CdCl2(0,10,20,40μmol/L)作用LLC-PK1细胞,8 h后bcl-2表达逐渐下降,并呈良好的剂量-反应关系(r=-0.910,P<0.05);4,8 h p53表达均明显下降,呈剂量-反应关系(r值分别为-0.716,-0.972,P均<0.05);8 h后c-myc表达逐渐下降,呈剂量-反应关系(r=-0.694,P<0.05);8 h后c-fos表达未见剂量-反应关系;8 h后ras表达逐渐下降,呈明显的剂量-反应关系(r=-0.887,P<0.05)。结论镉诱导LLC-PK1细胞凋亡的机制可能与镉抑制bcl-2、p53、c-mycr、as基因表达有关。

低氧对LLC-PK_1细胞增殖及去分化的影响

目的：研究低氧对近端肾小管细胞株（ＬＬＣ－ＰＫ１）细胞增殖和去分化的作用。方法：ＬＬＣ－ＰＫ１细胞分别置于低氧（３％Ｏ２）和正常氧（１８％Ｏ２）孵箱中培养，用３Ｈ－胸腺嘧啶掺入法和细胞计数，观察细胞增殖情况；以钠依赖葡萄糖和氨基异丁酸（ＡＩＢ）转运为指标，观察细胞分化程度；用放射核素法测定蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）活性。结果：与正常氧培养比较，低氧培养１６ｈ，３Ｈ－胸腺嘧啶掺入显著增加；培养２４ｈ，细胞数显著增加；培养７２ｈ，细胞摄取α－甲基糖甙和ＡＩＢ显著降低。细胞低氧培养４ｈ，细胞膜与细胞质ＰＫＣ活性比率增高，随后降至原先水平；但继续培养至２４ｈ，ＰＫＣ活性再次增高，直至７２ｈ，表明ＰＫＣ呈急性和持续双相激活。ＰＫＣ抑制剂可显著抑制低氧诱导的３Ｈ－胸腺嘧啶掺入，并显著增加α－甲基糖甙和ＡＩＢ转运。结论：慢性低氧可诱导ＬＬＣ－ＰＫ１细胞的增殖和去分化。

绞股蓝黄酮对氧化受损LLC-PK1细胞的保护作用

利用色谱法从绞股蓝中分离得到4个黄酮类化合物,通过MS及NMR分别被鉴定为槲皮素-3-O-(2″,6″-α-L-二鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(1)、槲皮素-3-O-(2″,6″-α-L-二鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、槲皮素-3-O-(2″-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃半乳糖苷(3)和槲皮素-3-O-(2″-α-L-鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)。其中化合物1～3为首次从葫芦科中分离得到。这4个黄酮化合物体外对DPPH,·OH和■自由基均有较强的清除作用,尤其是对DPPH自由基的清除能力,IC_(50)分别为71.4,29.5,48.3,79.2μmol·L^(-1)。此外,这4个黄酮化合物对AAPH诱导氧化受损的猪肾小管上皮LLC-PK1细胞具有保护作用,抑制细胞丙二醛(MDA)的升高及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的减少。尽管还需要进一步的研究来证明其在体内和临床试验中的有效性,但这项研究为在绞股蓝中寻找潜在的抗氧化剂提供了可能。

猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^(-3)接种于密度为2×10^(6) cells·mL^(-1)的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5μg·mL^(-1)时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。

庆大霉素诱导LLC—PK1细胞凋亡的实验研究

目的：观察庆大霉素是否能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生凋亡诱导，并探讨细胞凋亡与庆大霉素肾毒性之间的关系。方法：将体外培养的猪肾近端小管上皮细胞（LLC－PK1细胞）与0．2－3.2mg/ml浓度的庆大霉素共同培养达24－96h，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，HE染色观察凋亡细胞形态变化，MTT法测定庆大霉素对LLC－PK1细胞增 殖的抑制率，抽提细胞DNA行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋的梯形条带，流式细胞术测定细胞凋亡率。结果：庆大霉素对LLC－PK1细胞增殖有抑制作用，庆大霉素具诱导LLC－PK1细胞凋亡的作用，凋亡率呈药物浓度和作用时间的依赖性。结论：庆大霉素的肾毒性可能与其诱导体内肾小管上皮细胞凋亡有关。

马兜铃酸Ⅰ致肾小管上皮细胞DNA损伤的逆转性实验

目的:研究探讨马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)对猪肾小管上皮细胞(LLC -PK1细胞)DNA损伤和细胞周期阻滞是否具有可逆性。 方法:采用LLC- PK1细胞为实验对象,选择不同浓度的AAⅠ(80, 320,和1 280ng/ml)体外刺激LLC- PK1细胞24h,然后去除含有AAⅠ的培养基,换不含AAⅠ的培养基继续培养细胞24和48h。同时设不加AAⅠ的细胞为对照组。采用单细胞凝胶电泳(又称彗星实验)检测经不同剂量AAⅠ处理的LLC- PK1细胞不同时间点DNA损伤情况,流式细胞仪技术检测它们对LLC -PK1细胞周期的影响。 结果:AAⅠ(80ng/ml)组细胞彗星实验为阴性,但AAⅠ(320和1 280ng/ml)导致细胞DNA损伤,出现明显的彗星拖尾现象,且细胞在G2 /M期的比例也明显增加,均呈剂量依赖性(P<0. 01 )。用不含AAⅠ的培养基继续培养细胞24和48h后,AAⅠ( 320ng/ml)组彗星拖尾现象明显减轻至消失,G2 /M期细胞的比例与同时间对照组比较无明显差异(P>0 .05 )。而AAⅠ(1280ng/ml)组彗星拖尾现象无明显改善(P<0. 01),G2 /M期细胞的比例仍明显高于同时间正常对照组(P<0 .05)。 结论:AAⅠ可导致LLC- PK1细胞DNA损伤,使细胞周期阻滞在G2 /M期。低剂量AAⅠ造成的DNA损伤可完全恢复,细胞进入正常的细胞周期,但高剂量所致DNA损伤不可逆转。

刺尾鱼毒素对LLC-PK_1细胞的毒性及钙通道阻滞剂的拮抗效应

目的 研究刺尾鱼毒素 (MTX)的细胞毒性及钙通道阻断剂的拮抗效应 ,为探讨可能的防治途径提供依据。方法 采用噻唑蓝 (MTT)比色法检测MTX对细胞的毒性效应及荧光分光光度法测定胞浆内游离Ca2 +的浓度。结果 MTX对LLC PK1细胞的毒性效应有良好的剂量和时间效应关系。MTX 8ng/ml作用 3h已呈现明显的毒性效应 ,随着MTX剂量的增加 ,细胞存活率明显降低 ,与对照组相比差异有极显著性。随着MTX剂量的增加和作用时间的延长其毒性逐渐增大。Ca2 +通道拮抗剂维拉帕米 5× 10 -5mol/L、硝苯吡啶 1× 10 -4mol/L能明显拮抗MTX所致LLC PK1细胞的Ca2 +内流 ;维拉帕米和硝苯吡啶 1× 10 -5mol/L、5× 10 -5mol/L、1× 10 -4mol/L均能够明显降低MTX引起的细胞毒性死亡 ,提高细胞的存活率。结论 MTX的细胞毒性可能是由于细胞内Ca2 +浓度升高引起 ,Ca2

本周氏蛋白催化作用与多发性骨髓瘤患者肾损伤的关系

本研究通过体外细胞实验观察多发性骨髓瘤(MM)患者尿中本周氏蛋白(Bence Jones protein,BJP)酰胺酶催化作用与肾小管细胞毒性作用的关系,进一步了解BJP对MM肾损伤的毒性机制。测定13例MM患者尿BJP的酰胺酶动力学参数米氏常数(Km)和催化常数(kcat);以不同浓度BJP与猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)共同培养24 h后,用MTT法测定细胞增殖抑制率;以明显抑制细胞增殖的BJP浓度与LLC-PK1细胞共同培养后使用流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,临床出现肾损伤的MM患者尿中BJP较未出现肾损伤MM患者尿中BJP更易对LLC-PK1细胞产生毒性作用,且BJP的kcat值越高,对LLC-PK1细胞毒性作用越强。流式细胞仪检测发现,BJP能够诱导LLC-PK1细胞发生凋亡及坏死,毒性作用随BJP浓度的增高而增强。结论:BJP能够对肾小管上皮细胞产生直接毒性作用,并随BJP浓度的增高而增强;BJP酰胺酶催化作用强度与其毒性作用呈正相关,其可能是MM患者发生肾损伤的机制之一。

中药连翘体外抗氧化作用的研究

本文采用活性跟踪组分(bioassay-linked fractionation)方法确定连翘中的有效部位.用二苯代苦味肼基自由基[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)]消除实验及SIN-1诱导肾上皮细胞LLC-PK1氧化损伤的保护实验方法,对连翘的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水的萃取物进行抗氧化作用评价.结果从连翘的正丁醇萃取物和二氯甲烷萃取物具有很强的抗DPPH自由基的抗氧化活性,其半数有效值IC50分别为79.69和27.75μg/mL.尤其是二氯甲烷萃取物具有最强的抗氧化活性(P<0.05).而且这两个有效部位浓度依赖性地恢复因SIN-1处理而降低的细胞生存能力(P<0.01),进而说明它们对细胞氧化损伤起到保护作用.

Mitochondria as the main source of vanadyl acetylacetonate-induced reactive oxygen species generation in renal epithelial cell lines

In this study, we aimed to clarify the source of the reactive oxygen species （ROS） generation induced by vanadium compounds. We used vanadyl acetylacetonate （VO（acac）2）, a highly effective agent in controlling hyperglycemia, to determine the source of ROS generation in two renal cell lines LLC-PK1 and MDCK. Four commonly fluorescent dyes were used to assess VO（acac）2-induced H202 and ＂02 production and their location. It demonstrated that VO（acac）2 can induce significant ROS generation in both LLC-PKI and MDCK cells, which were primarily derived from mitochondria. The results obtained in this study raised the possibility to reduce ROS level induced by vanadium compounds locally and thus avoid affecting its activity.