Lnc721靶向调控MMP9对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【背景】肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础,在哺乳动物肌肉中,将近一半的肌肉为骨骼肌,骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合,逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束。在机体内,骨骼肌不仅参与动物生长,也参与呼吸、代谢等生理活动。目前许多研究表明,lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用,是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子。但由于lncRNA作用机制复杂,方式多样,在物种间保守型很低,故不同种属动物lncRNA之间作用关系不大,且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内,而对牛肌肉生长影响的研究内容极少。近年来,人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用,进而调控肌肉细胞的发生过程。【目的】在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉,进行高通量测序,获得高表达差异的lncRNA,在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上,探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系,以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响,以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考。【方法】前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用,且对其分化具有负调控作用。为了进一步探究lnc721对牛肌肉发育的调控通路。分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了3个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组,与3个对照组采用NGS技术进行转录组测序,以期获得lnc721差异靶基因,进一步研究lnc721对牛骨骼肌发育的调控通路。根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果,试验选取MMP9作为lnc721的靶基因,并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测。设计并合成lnc721及MMP9干扰序列,转染至牛骨骼肌卫星细胞中,通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响。并且通过下调MMP9,采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况,以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响。【结果】CatRAPID结果显示,lnc721与MMP9结合倾向为0.75,共有9个结合位点,二者存在互作结合。干扰lnc721之后,采用qRT-PCR分析,结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达(P<0.01),而在分化期则极显著促进MMP9的表达(P<0.01),证实了MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因。进而下调MMP9,检测对增殖期细胞的影响,发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调(P<0.01),Pax7蛋白表达量显著上调(P<0.05),EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高。同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响,发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成,同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01),MyoG蛋白表达量显著下调(P<0.05)。【结论】lnc721与MMP9相互结合。在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达,而在分化期促进MMP9的表达,且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化。证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育。

干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

【目的】探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA(lnc721),通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax 7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达(P<0.01),在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调(P<0.01)。【结论】干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。