基于lncRNA AL158206.1-ce RNA-miRNA-19a-3p对FOXP1的调控探索重楼皂苷Ⅶ抑制NSCLC细胞的分子机制

目的:基于lncRNA AL158206.1-ceRNA-miRNA-19a-3p对叉头框蛋白P1(forkhead box protein P1,FOXP1)的调控探索重楼皂苷Ⅶ(Paris saponin Ⅶ,PP7)抑制非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)细胞的分子机制。方法:Targetscan软件预测miRNA-19a-3p与FOXP1 mRNA 3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)的结合;Starbase软件预测miRNA-19a-3p与lncRNA AL158206.1的结合,并通过TCGA数据库阐述miRNA-19a-3p与lncRNA AL158206.1在多个肿瘤中的表达关系;Western blot和qPCR实验检测多种NSCLC中FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p的表达;MTT检测PP7对HCC827活力的影响;选取2、4、8μmol/L浓度的PP7干预HCC827细胞24 h(n=3),同时采用短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默技术构建lncRNA AL158206.1RNA沉默慢病毒载体,并合成miRNA-19a-3p的抑制剂(miRNA inhibitor),转染细胞,分组干预,分组如下:空白组(无任何处理的正常培养细胞)、shRNA lncRNA组(转染shRNA慢病毒载体沉默lncRNA AL158206.1)、miRNA inhibitor组(转染miRNA inhibitor下调miRNA-19a-3p)、PP7组(4μmol/L PP7干预细胞24 h)、PP7+shRNA lncRNA组(在沉默lncRNA AL158206.1基础上用4μmol/L PP7干预细胞24 h)、PP7+shRNA lncRNA+miRNA inhibitors组(在沉默lncRNA AL158206.1和用4μmol/L PP7干预细胞24 h的基础上再用miRNA inhibitors转染细胞)(n=3),分别用流式细胞术检测各组细胞凋亡变化,caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组细胞中caspase-3/7活性,Western blot与qPCR实验检测各组细胞中miRNA-19a-3p、FOXP1、lncRNA AL158206.1的表达。结果:预测显示miRNA-19a-3p与FOXP1 mRNA 3,-UTR具有特异性结合位点,miRNA-19a-3p与lncRNA AL158206.1具有特异性结合位点。进一步分析显示在多个肿瘤中miRNA-19a-3p与lncRNA AL158206.1具有显著负相关性(P<0.05)。在多个NSCLC中,相对于正常BEAS-2B细胞,HCC827细胞中FOXP1、lncRNA AL158206.1和miRNA-19a-3p的表达变化最显著(P<0.01)。PP7可时间-浓度依赖地抑制HCC827细胞活力,诱导HCC827细胞凋亡(P<0.01),上调HCC827细胞中caspase-3/7活性(P<0.01),提高HCC827细胞中FOXP1、lncRNA AL158206.1表达量(P<0.01),而抑制miRNA-19a-3p的表达(P<0.01)。进一步显示HCC827细胞中lncRNA AL158206.1的沉默并未影响细胞凋亡和caspase-3/7活性,但可提高miRNA-19a-3p的表达(P<0.01),抑制FOXP1 mRNA和蛋白表达(P<0.01);加入miRNA-19a-3p抑制剂和PP7单独干预后可显著促进HCC827细胞凋亡和caspase-3/7活性(P<0.01),提高lncRNA AL158206.1和FOXP1表达(P<0.01),抑制miRNA-19a-3p表达(P<0.01)。沉默lncRNA AL158206.1可逆转PP7对HCC827细胞凋亡和caspase-3/7活性的影响以及对lncRNA AL158206.1、miRNA-19a-3p、FOXP1表达的影响(P<0.01)。加入miRNA-19a-3p抑制剂可逆转lncRNA AL158206.1沉默对PP7对细胞凋亡和caspase-3/7活性以及miRNA-19a-3p、FOXP1表达的逆转作用(P<0.01)。结论:PP7可通过增强lncRNA AL158206.1-ceRNA-miRNA-19a-3p作用,降低miRNA-19a-3p对FOXP1表达抑制作用,从而提高FOXP1的表达,抑制NSCLC。

lncRNA AL158206.1/miR-340-5p/ARL4C轴对食管癌增殖和迁移的调控作用

目的观察长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)AL158206.1在食管癌细胞系中的表达,探讨其通过调控miR-340-5p/ARL4C轴对食管癌细胞增殖和迁移的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测AL158206.1在食管癌细胞系及人食管上皮细胞中的表达水平。分别转染AL158206.1质粒(AL158206.1组)和NC质粒(NC组)至AL158206.1表达最低的食管癌细胞系。采用MTT法和Transwell试验检测食管癌细胞增殖和迁移。生物信息学预测AL158206.1的靶基因。采用qRT-PCR和Western blotting法分别测定AL158206.1靶基因的表达。结果与人食管上皮细胞相比,AL158206.1在食管癌细胞系中表达水平明显降低(P<0.05),AL158206.1在KYSE30细胞中的表达最低(P<0.01)。与NC组相比,AL158206.1组中食管癌KYSE30细胞的增殖能力明显降低(P<0.05),KYSE30细胞的迁移能力明显降低(P<0.05)。AL158206.1的靶基因可能是miR-340-5p,miR-340-5p的靶基因可能是ADP-核糖基化样因子4C(ARL4C)。与NC组相比,AL158206.1组中KYSE30细胞中miR-340-5p表达水平减少(P<0.01),ARL4C在mRNA和蛋白水平表达增高(P<0.01)。结论AL158206.1在食管癌细胞系中低表达,AL158206.1可能通过调控miR-340-5p/ARL4C轴抑制食管癌KYSE30细胞的增殖和迁移能力。

LncRNA AL110200对脂多糖刺激的应答及其靶基因预测与鉴定

目的炎症反应被认为是动脉粥样硬化的始动环节,也是防止动脉粥样硬化的重要靶点。众多基因参与调控此过程,PPARβ/δ可通过参与炎症反应从而影响动脉粥样硬化。我们通过生物信息学分析发现lncRNA AL110200可能影响PPARβ/δ的表达,从而我们推测lncRNA AL110200可能通过调节PPARβ/δ表达从而影响动脉粥样硬化炎症反应。本研究旨在通过体外实验研究lncRNA AL110200对炎症刺激物脂多糖的应答并初步验证其靶基因。方法我们首先使用qRT-PCR检测在炎症刺激物脂多糖(LPS)刺激下lncRNA AL110200表达量的改变;然后我们再利用qRT-PCR检测了lncRNA AL110200干扰和过表达后PPARβ/δmRNA表达水平的改变。结果我们研究发现LPS可上调lncRNA AL110200(1.85倍,P<0.001)和PPARβ/δ(2.67倍,P<0.01)表达;但是无论高表达还是低表达lncRNA AL110200都不影响PPARβ/δ的表达。结论综上所述,我们的研究发现,动脉粥样硬化炎症刺激物LPS可以上调lncRNA AL110200及PPARβ/δ表达,但是PPARβ/δ非lncRNA AL110200的靶基因。