血清lncRNA HOTTIP表达对胰腺癌患者的诊断及预后意义

目的探究胰腺癌患者血清中lncRNA HOTTIP的表达差异,其与胰腺癌临床病理特征及其对诊断预后的相关性。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测胰腺癌患者及健康者血清lncRNA HOTTIP表达差异,采用ROC曲线探究lncRNA HOTTIP对胰腺癌早期诊断价值,采用卡方检验分析其与胰腺癌临床指标的相关性,并采用Cox回归分析探究HOTTIP对患者预后的影响。结果胰腺癌患者血清中HOTTIP呈显著高表达(t=12.289,P<0.001);HOTTIP对胰腺癌诊断曲线下面积AUC为0.899,敏感度、特异度分别为97.5%、81.0%;lncRNA HOTTIP与胰腺癌的分化程度、临床分期以及肿瘤标志物CA199的表达呈显著相关性(χ^(2)分别为8.523、11.899、9.950,P<0.05);另外HOTTIP可以作为胰腺癌预后独立预测因子(HR=2.495,P=0.006)。结论lncRNA HOTTIP可以作为胰腺癌患者早期诊断的潜在标志物及预后的独立预测因子。

lncRNA HOTTIP通过miR-637/KLK4轴促进肺癌SPC-A-1细胞的恶性生物学行为

目的:探讨lncRNA HOTTIP对肺癌细胞增殖、凋亡及EMT的影响及其作用机制。方法:利用qPCR检测lncRNA HOTTIP、miR-637和KLK4在肺癌SPC-A-1、正常肺上皮BEAS-2B细胞中的表达量;siRNA干扰SPC-A-1细胞中lncRNA HOTTIP的表达后,分别通过CCK-8、Transwell、流式细胞术和WB法检测SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT能力的变化。miRanda软件和双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA HOTTIP和miR-637之间的靶向关系,RNA pull-down实验检测lncRNA HOTTIP和miR-637的吸附作用,检测lncRNA HOTTIP通过miR-637对SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT的调控。利用TargetScan软件分析miR-637与KLK4的相关性,双荧光素酶报告基因实验检测miR-637与KLK4 mRNA之间的相互作用;检测miR-637通过KLK4 mRNA对SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT的调控。下调lncRNA HOTTIP和miR-637表达后,利用qPCR和WB检测KLK4 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:与BEAS-2B细胞比,在SPC-A-1细胞中lncRNA HOTTIP呈高表达(P<0.01),miR-637呈低表达(P<0.01),KLK4呈高表达(P<0.01)。下调lncRNA HOTTIP后,SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT能力显著减弱,细胞凋亡率显著上升(P<0.01);lncRNA HOTTIP与miR-637具有靶向关系;下调miR-637表达后,SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT能力显著上升,细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。miR-637与KLK43’UTR特异性结合。miR-637通过KLK4显著促进了SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT,细胞凋亡率显著上升(P<0.01)。下调lncRNA HOTTIP使KLK4表达显著降低,而下调miR-637可促进KLK4表达(P<0.05)。结论:上调lncRNA HOTTIP可通过miR-637/KLK4轴促进肺癌SPC-A-1细胞的增殖、侵袭与EMT而抑制癌细胞凋亡。

乳腺癌患者血清外泌体lncRNA HOTTIP的表达及临床意义

目的探究血清外泌体lncRNA HOTTIP在乳腺癌(breast cancer,BC)患者中的临床预后价值。方法采用试剂盒提取98例BC患者、50例良性乳腺疾病(benign breast disease,BBD)患者和50例健康人血清中的外泌体;采用RT-qPCR检测血清外泌体中HOTTIP的表达水平,进一步分析HOTTIP表达与患者临床病理学特征及总生存期的关系。结果BC患者血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达水平明显高于BBD患者(t=8.790,P<0.001)和正常健康人(t=11.540,P<0.001),且手术后BC患者血清外泌体中的HOTTIP水平显著降低(t=14.570,P<0.001)。临床病理分析显示,高血清外泌体HOTTIP水平与HER2表达水平、淋巴结转移和TNM分期显著相关(P_(均)<0.05)。生存分析表明,血清外泌体HOTTIP高表达组BC患者的5年生存率显著低于低表达组(χ^(2)=5.548,P=0.019);多因素分析显示,血清外泌体HOTTIP高表达是导致BC患者预后不佳的独立危险因素(HR=2.454,95%CI:1.142~7.005,P=0.031)。结论血清外泌体lncRNA HOTTIP在BC中表达上调,其高表达提示肿瘤的恶性进展和患者的不良预后,有望成为BC患者预后评估的非侵入性生物标志物。

LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治术后肿瘤复发、耐药及预后中的作用

目的分析LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治术后肿瘤复发、耐药及预后中的作用。方法随机选取2018年1月至2020年6月在湖州市中心医院行胃癌D2根治术的126例胃癌患者作为研究对象。结果胃癌组织中LncRNA HOTTIP表达水平明显升高,胃癌组织LncRNA HOTTIP表达水平与TNM分期、淋巴结转移、侵袭深度及术后复发明显相关。TNM分期、侵袭深度越高并伴有淋巴结转移及术后复发的患者LncRNA HOTTIP越高。Kaplan-Meier生存曲线分析,LncRNA HOTTIP高表达组患者生存期均明显低于LncRNA HOTTIP低表达组患者。SGC7901/DDP组细胞LncRNA HOTTIP表达水平明显高于SGC7901组(P<0.01)。LncRNA HOTTIP低表达组细胞增殖能力及凋亡能力明显强于对照组,存活率明显低于对照组(P<0.05)。结论LncRNA HOTTIP在胃癌组织中的表达水平明显升高,且其表达水平与患者的复发及预后明显相关;经实验发现,下调LncRNA HOTTIP的表达能够明显抑制细胞增殖,抑制细胞活性,促进细胞凋亡,降低胃癌细胞的耐药性,提高对化疗药物的敏感性。

LncRNA HOTTIP调节miR-615/IGF2分子轴促进肺癌细胞增殖和侵袭的实验研究

目的探讨长链非编码RNA同源异型基因簇A远端转录本(lncRNA HOTTIP)对肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法体外培养A549细胞,构建HOTTIP敲降载体、miR-615 inhibitor转染A549细胞,分为空白对照组、阴性对照组、HOTTIP shRNA组、HOTTIP shRNA+无序序列组、HOTTIP shRNA+miR-615 inhibit表达ors组。采用MTT、Transwell、免疫荧光法检测下调HOTTIP表达对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响。采用双荧光素酶报告实验检测lncRNA HOTTIP、miR-615及IGF2的靶向调控关系。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blotting检测HOTTIP、miR-615和IGF的表达量。结果A549细胞中HOTTIP相对表达量为1.74±0.08,高于BEAS-2B细胞的1.00±0.05(P<0.001)。HOTTIP shRNA组,HOTTIP相对表达量为0.43±0.04,低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。下调HOTTIP表达后,A549细胞增殖、侵袭和迁移活性低于空白对照组(P<0.05),细胞凋亡率相应增加(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实HOTTIP靶向作用miR-615,而miR-615可负调控IGF2的表达。HOTTIP shRNA组细胞miR-615表达量高于空白对照组,IGF2 mRNA表达量低于阴性对照组,而HOTTIP shRNA+miR-615 inhibitors组IGF2 mRNA和蛋白表达量较HOTTIP shRNA组升高(P<0.05)。结论敲除A549细胞中lncRNA HOTTIP表达后可通过上调miR-615并下调IGF2进而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭活性。

血清外泌体介导lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p/TJP1轴调控胃癌细胞顺铂耐药的研究

目的探讨胃癌患者血清外泌体对胃癌细胞AGS顺铂耐药、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法分离胃癌患者血清外泌体,qRT-PCR检测血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达。体外培养正常胃上皮细胞株GES1、胃癌细胞株AGS、人胚肾细胞株293T。AGS细胞与外泌体(Exo)孵育,以PBS处理作为对照,随后转染si-NC或si-HOTTIP-3,设为Exo组、PBS组、si-NC+Exo组、si-HOTTIP-3+Exo组。AGS细胞分别转染si-NC、si-HOTTIP-1、si-HOTTIP-2、si-HOTTIP-3、oe-HOTTIP、vector、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic、oe-HOTTIP+mimic NC、miR-138-5p inhibitor、inhibitor NC、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1及miR-138-5p inhibitor+si-NC,设为si-NC组、si-HOTTIP-1组、si-HOTTIP-2组、si-HOTTIP-3组、oe-HOTTIP组、vector组、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组、oe-HOTTIP+mimic NC组、miR-138-5p inhibitor组、inhibitor NC组、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组及miR-138-5p inhibitor+si-NC组。293T细胞转染mimic NC+HOTTIP wt、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt、mimic NC+HOTTIP mut、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut、mimic NC+TJP1 3′UTR wt、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt、mimic NC+TJP1 3′UTR mut、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR mut分别设为mimic NC+HOTTIP wt组、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt组、mimic NC+HOTTIP mut组、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut组、mimic NC+TJP1 3′UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt组、mimic NC+TJP1 3′UTR mut组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR mut组。CCK8实验检测细胞的顺铂敏感性,平板克隆检测细胞克隆形成,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot实验检测外泌体标志蛋白CD63和CD81、TJP1及耐药相关蛋白P-gp、MCL-1的表达,双荧光素酶实验验证lncRNA HOTTIP、miR-138-5p和TJP1之间的靶向关系。观察指标:(1)lncRNA HOTTIP的表达情况。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。(4)miR-138-5p靶向TJP13′非编码区检测情况。(5)抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Tukey′s检验。计数资料以绝对数表示,组间比较采用χ^(2)检验。相关性分析采用Pearson检验。结果(1)lncRNA HOTTIP的表达情况。lncRNA HOTTIP在胃癌患者血清外泌体中的表达高于在健康志愿者血清外泌体中的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。透射电子显微镜结果显示:血清外泌体呈圆形或卵圆形;Western blot检测结果显示:血清外泌体中存在标志性蛋白CD63和CD81的表达。(2)血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。与PBS组比较,Exo组半抑制浓度(IC50)、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-NC+Exo组比较,si-HOTTIP-3+Exo组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与vector组比较,oe-HOTTIP组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与oe-HOTTIP+mimic NC组比较,oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)miR-138-5p靶向TJP13′非编码区检测情况。双荧光素酶实验显示:mimic NC+TJP13′UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP13′UTR wt组的荧光素酶活性分别为1.00±0.09、0.21±0.03,差异有统计学意义(t=15.02,P<0.05)。(5)抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与inhibitor NC组比较,miR-138-5p inhibitor组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高,细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-138-5p inhibitor+si-NC组比较,miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论血清外泌体介导lncRNA HOTTIP通过调控胃癌细胞中miR-138-5p/TJP1的表达,促进胃癌细胞的顺铂耐药性、克隆形成、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。

LncRNA HOTTIP通过调控miR-101对胰岛β细胞功能的影响

目的探讨lncRNA HOTTIP对胰岛β细胞功能的作用及潜在机制。方法选取30例GDM孕妇为GDM组,以及30例健康孕妇为对照组。培养大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞,将Vector、pcDNA-HOTTIP、NC-siRNA、HOTTIP-siRNA、pcDNA-HOTTIP+NC mimic、pcDNA-HOTTIP+miR-101 mimic分别转染至INS-1细胞,RT-qPCR实验检测lncRNA HOTTIP、miR-101的表达水平;葡萄糖测定试剂盒检测血糖水平;ELISA方法测量胰岛素分泌水平;CCK-8方法测定细胞增殖能力;生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验预测和验证lncRNA HOTTIP和miR-101之间的靶向关系。结果GDM孕妇中血糖水平升高,lncRNA HOTTIP表达水平下调,miR-101表达水平显著上调(P<0.05)。过表达HOTTIP促进INS-1细胞增殖能力和胰岛素分泌水平(P<0.05);敲低HOTTIP抑制INS-1细胞增殖能力和胰岛素分泌水平(P<0.05)。LncRNA HOTTIP直接靶向miR-101并负调控其表达,过表达miR-101可显著逆转HOTTIP对胰岛β细胞功能的作用。结论lncRNA HOTTIP过表达可通过调控miR-101促进INS-1细胞增殖和胰岛素产生。

沉默lncRNA HOTTIP通过上调miR-663a表达增加非小细胞肺癌细胞系放射敏感性

目的探讨lncRNA HOTTIP通过调控miR-663a表达对4个非小细胞肺癌细胞系放射敏感性影响。方法用0、2、4、6、8 Gy分别照射H838、H157、A549、H1299细胞系,采用克隆形成实验检测细胞存活情况。qRT-PCR检测细胞中HOTTIP和miR-663a表达水平。以A549、H1299细胞为研究对象,沉默HOTTIP表达、过表达miR-663a后用克隆形成实验检测细胞存活情况。流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和γ-H2AX表达。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR检测验证HOTTIP和miR-663a的靶向关系。结果HOTTIP在放射耐受的H157、A549、H1299细胞中表达上调,miR-663a表达下调。沉默HOTTIP或过表达miR-663a均可抑制A549、H1299细胞存活(放射增敏比分别为1.562、1.507),促进Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和γ-H2AX表达,促进放射照射诱导细胞凋亡。miR-663a是HOTTIP的靶基因,HOTTIP可负性调控miR-663a的表达。抑制miR-663a表达可逆转沉默HOTTIP对肺癌细胞系放射敏感性的影响。结论沉默HOTTIP通过上调miR-663a表达,抑制肺癌细胞系存活,促进其凋亡,从而提高肺癌细胞系的放射敏感性。

lncRNA-HOTTIP及miR-21在妊娠期糖尿病患者中的表达及意义

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)-HOXA远端转录本(HOTTIP)及微小RNA-21(miR-21)在妊娠期糖尿病(GDM)患者血清中的表达及意义。方法:选取GDM孕妇89例为GDM组,选取同期正常孕妇90例为对照组,运用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测2组血清中lncRNA-HOTTIP及miR-21表达,比较2组的差异;采用ROC曲线评估lncRNA-HOTTIP及miR-21对GDM早期诊断价值;采用Pearson相关性分析探究lncRNA-HOTTIP及miR-21与GDM临床指标关系,χ^(2)检验检测lncRNA-HOTTIP及miR-21与妊娠不良结局关系。结果:与正常孕妇相比,GDM患者血清中lncRNA-HOTTIP及miR-21表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),lncRNA-HOTTIP、miR-21及联合分析对GDM诊断曲线下面积分别为0.904、0.872、0.949;lncRNA-HOTTIP、miR-21与患者外周血生化指标及孕妇BMI呈显著相关性(P<0.05);lncRNA-HOTTIP、miR-21与巨大儿及总妊娠不良结局发生率相关。结论:lncRNA-HOTTIP及miR-21可以作为GDM诊断及不良妊娠结局的预测因子。

长链非编码RNA HOTTIP对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOXA末端转录本反义RNA(HOXA transcript at the distal tip,HOTTIP)对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法将HOTTIP小干涉RNA(siRNA)及negative siRNA转染He La和C-33A宫颈癌细胞系,通过实时荧光定量PCR(q PCR)技术确认HOTTIP在细胞中表达水平的敲低,采用CCK8及克隆形成实验检测HOTTIP降低表达后对He La和C-33A细胞增殖的影响,细胞划痕实验检测HOTTIP降低表达后对He La和C-33A细胞增殖及迁移能力的影响,Matrigel细胞侵袭实验检测HOTTIP降低表达后对He La及C-33A侵袭能力的影响。结果向宫颈癌细胞系He La和C-33A中转染HOTTIP siRNA 48 h后,经q PCR检测He La及C-33A细胞中HOTTIP均出现明显下调;CCK8及克隆形成实验结果显示,HOTTIP降低表达能显著抑制He La及C-33A细胞的增殖(P<0.01);细胞划痕实验结果显示,HOTTIP降低表达能减弱He La和C-33A细胞增殖及迁移能力;Matrigel细胞侵袭实验结果显示,HOTTIP降低表达能减弱He La及C-33A侵袭能力。结论HOTTIP siRNA转染He La及C-33A宫颈癌细胞系能有效降低HOTTIP的表达,同时HOTTIP降低表达后能抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。