lncRNA HOXA⁃AS2在胰腺癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭力的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)HOXA簇反义RNA2(HOXA⁃AS2)在胰腺癌组织中表达,以及沉默该基因对胰腺癌细胞增殖和侵袭力的影响。方法选取2015年8月至2020年8月在我院行根治性手术治疗的胰腺癌患者97例,培养人胰腺癌PANC⁃1和AsPC⁃1细胞并分别分为si⁃HOXA⁃AS2组、si⁃Con组和空白组,分别转染干扰序列、阴性对照序列和不作任何处理,使用RT⁃PCR检测胰腺癌和癌旁组织中HOXA⁃AS2表达,以及不同组细胞中HOXA⁃AS2表达,分别使用CCK⁃8和Transwell法检测细胞增殖活性及细胞侵袭力。结果HOXA⁃AS2在胰腺癌组织中表达量为(2.21±0.20),高于癌旁组织的(1.03±0.14),差异有统计学意义(t=48.030,P<0.001);胰腺癌组织中HOXA⁃AS2表达量在不同TNM分期、分化程度和是否发生淋巴结转移差异有统计学意义(P<0.05);PANC⁃1和AsPC⁃1细胞中,与si⁃Con组和空白组比较,si⁃HOXA⁃AS2组HOXA⁃AS2表达量明显降低(P<0.05),si⁃HOXA⁃AS2组24、48、72和96 h时吸光度OD值均低于si⁃Con组和空白组(P<0.05),si⁃HOXA⁃AS2组侵袭细胞数均低于si⁃Con组和空白组(P<0.05)。结论HOXA⁃AS2在胰腺癌组织中表达量升高,且与恶性进展临床指标相关,沉默其表达可减少细胞增殖、抑制细胞侵袭力。

敲降lncRNA UCA1降低人膀胱癌细胞系T24对吉西他滨耐药

目的探讨lncRNA UCA1对人膀胱癌细胞系T24体外对吉西他滨(GEM)耐药的影响及相关分子机制。方法用RT-qPCR检测T24细胞和T24/GEM细胞中UCA1 mRNA表达。用不同浓度GEM(0.1、1和10μmol/L)刺激T24/GEM细胞48 h,用LC3染色法观察自噬斑,Western blot检测自噬相关蛋白质表达。将UCA1-shRNA或UCA1-shRNA+pcDNA-Bcl-2转入T24/GEM细胞,用MTT法和流式细胞测量术评估细胞对GEM的敏感性;用Western blot检测p53、Bcl-2和自噬相关蛋白质的表达。结果T24/GEM细胞中UCA1的表达显著高于亲本T24细胞(P<0.05)。在0~10μmol/L浓度范围的GEM呈依赖性促进T24/GEM细胞自噬(P<0.05)。敲降UCA1后,T24/GEM细胞对GEM的敏感性增加(P<0.05),自噬能力减弱(P<0.05),p53和Bcl-2表达降低(P<0.05)。Bcl-2过表达能部分逆转UCA1-shRNA对T24/GEM细胞的GEM增敏和抑制自噬的作用(P<0.05)。结论敲降lncRNA UCA1通过抑制Bcl-2介导的自噬降低T24/GEM细胞对GEM的耐药性。

2型糖尿病患者血清LncRNA MEG3水平与糖尿病肾病的关系分析

目的探讨2型糖尿病患者血清LncRNA MEG3水平与糖尿病肾病的相关性。方法选取140例2型糖尿病患者,依据尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)分为正常蛋白尿组(UACR<30 mg/g)45例、微量蛋白尿组(UACR 30~300 mg/g)47例、大量蛋白尿组(UACR>300 mg/g)48例。选取同期于本院进行健康体检的50例健康人群为对照组。收集2型糖尿病患者临床资料,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测患者血清LncRNA MEG3水平,分析血清LncRNA MEG3水平与临床指标的相关性及其对糖尿病肾病的诊断价值。结果相较于对照组,正常蛋白尿组、微量蛋白尿组及大量蛋白尿组患者血清LncRNA MEG3表达均显著上调(P<0.05)。微量蛋白尿组和大量蛋白尿组空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FIns)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、糖化血红蛋白(HbA1c)、收缩压(SBP)、血肌酐(SCr)、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血清LncRNA MEG3高于正常蛋白尿组,且大量蛋白尿组高于微量蛋白尿组(P<0.05)。大量蛋白尿组舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)高于正常蛋白尿组(P<0.05)。血清LncRNA MEG3水平与T2DM病程、FPG、FIns、HOMA-IR、HbA1c、SBP、DBP、TC、LDL-C、SCr、UACR、IL-6、TNF-α、TGF-β1呈正相关(P<0.05)。血清LncRNA MEG3水平诊断糖尿病肾病的AUC为0.960,以1.5为阈值,其诊断的灵敏度为94.74%、特异度为84.44%。结论糖尿病肾病患者血清LncRNA MEG3水平明显升高,且与糖脂代谢、胰岛素抵抗及炎症因子相关,对糖尿病肾病具有较好的诊断价值。

LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中的作用及其机制研究

目的探索LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中的功能及可能的机制。方法原位杂交和免疫组织化学分别检测ZEB2-AS1和ZEB2在卵巢癌组织中的表达;建立ZEB2-AS1的过表达和沉默SKOV3细胞模型;CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡和周期;细胞免疫荧光和Western blotting检测上皮-间充质相互作用(EMT)相关蛋白的表达;双萤光素酶基因报告实验检测ZEB2-AS1与ZEB2、microRNA-145(miR-145)的结合关系。结果ZEB2-AS1和ZEB2均表达于卵巢癌组织中的细胞质和细胞核;相比SKOV3细胞,ZEB2-AS1过表达的SKOV3细胞增殖能力增强(P<0.05),凋亡能力减弱(P<0.05),侵袭和迁移能力增强(P<0.05),S期细胞数增加(P<0.05),G1期细胞数减少(P<0.05);EMT相关蛋白E-cadherin相对表达量降低(P<0.05),N-cadherin和Vimentin相对表达量升高(P<0.05);而ZEB2-AS1沉默的SKOV3细胞则相反。双萤光素酶报告实验结果证实,ZEB2-AS1和miR-145具有结合关系,ZEB2-AS1与ZEB2 mRNA具有结合关系。结论LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中发挥促EMT的功能作用。

咪达唑仑通过调控LncRNA NR2F2-AS1对肾癌786-O细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 探讨咪达唑仑对肾癌786-O细胞增殖、迁移及凋亡的影响及其可能作用机制。方法 体外培养人肾癌细胞786-O,随机分组:咪达唑仑0、20、40、60μmol/L组、si-NC组、si-核受体亚家族2组F成员反义RNA(NR2F2-AS)1组、咪达唑仑+pcDNA组、咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组;CCK-8法、流式细胞术与Transwell实验分别检测细胞增殖、凋亡及迁移;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA NR2F2-AS1表达量;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关蛋白(Bax)表达量。结果 与咪达唑仑0μmol/L组比较,咪达唑仑20、40、60μmol/L组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平明显升高,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显降低,长链非编码(Lnc)RNA NR2F2-AS1表达量明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);转染si-NR2F2-AS1可明显抑制细胞增殖及迁移,并可明显提高细胞凋亡率(P<0.05);与咪达唑仑+pcDNA组比较,咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平明显降低,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论 咪达唑仑可通过抑制LncRNA NR2F2-AS1表达而减弱肾癌细胞增殖及迁移能力,并可诱导肾癌细胞凋亡。

高糖培养条件下lncRNA CCAT2调控心肌细胞损伤和凋亡的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录本2(CCAT2)在高糖培养条件下心肌细胞中的表达变化及通过Wnt/β-catenin信号通路调控心肌细胞损伤和凋亡的机制。方法 体外培养人心肌细胞AC16,将细胞分为4组,对照组、高糖组、高糖+干扰RNA阴性对照组、高糖+干扰RNA组(干扰RNA的靶标为lncRNA CCAT2)。采用CCK8法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡率;实时荧光定量PCR(qPCR)检测lncRNA CCAT2、β-catenin、转录因子7类似物2(TCF7L2)、Caspase-3、c-Myc、细胞周期蛋白(Cyclin)D1基因的表达;Western blot检测β-catenin、TCF7L2、CyclinD1蛋白表达;检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。结果 高糖培养条件下的AC16心肌细胞lncRNA CCAT2的基因表达显著高于对照组(P<0.05),同时β-catenin、TCF7L2、Caspase-3、c-Myc、CyclinD1基因表达显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制(P<0.05),凋亡率增加(P<0.05),细胞培养液中LDH和AST活性显著升高(P<0.05),细胞中SOD活性显著降低(P<0.05)。高糖培养条件下,RNA干扰lncRNA CCAT2表达后,细胞增殖增加(P<0.05),细胞凋亡率显著下降(P<0.05),β-catenin、TCF7L2、Caspase-3、c-Myc、CyclinD1基因的表达下调(P<0.05),β-catenin(细胞核)、TCF7L2、CyclinD1蛋白表达显著下调(P<0.05),β-catenin(细胞质)蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论 高糖条件下,lncRNA CCAT2可通过Wnt/β-catenin信号通路调控心肌细胞损伤和凋亡。

沉默lncRNA MCF2L-AS1通过miR-138-5p/AnxA2轴抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探究lncRNA MCF2L-AS1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响与机制。方法:qRT-PCR检测正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系(MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231)中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p水平;将si-NC、si-MCF2L-AS1、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor分别转染至MDA-MB-415细胞并命名为si-NC组、si-MCF2L-AS1组、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC组、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor组,未做任何处理的MDA-MB-415细胞记为NC组。qRT-PCR检测MDA-MB-415细胞中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p表达;MTT法检测MDA-MB-415细胞增殖情况;流式细胞术检测MDA-MB-415细胞凋亡率;Transwell检测MDA-MB-415细胞侵袭、迁移数量;Western blot检测MDA-MB-415细胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、AnxA2蛋白水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、AnxA2的关系;小鼠异种移植实验检测肿瘤生长。结果:与MCF-10A细胞相比,MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231细胞中lncRNA MCF2L-AS1、AnxA2水平显著上调(P<0.05),miR-138-5p表达显著下调(P<0.05)。与NC组、si-NC组相比,si-MCF2L-AS1组MDA-MB-415细胞OD 560 nm值、迁移、侵袭细胞数量、lncRNA MCF2L-AS1表达、N-cadherin、Vimentin蛋白水平、小鼠肿瘤体积、肿瘤质量显著下降(P<0.05),MDA-MB-415细胞凋亡率、miR-138-5p表达、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);而抑制miR-138-5p表达减弱了沉默lncRNA MCF2L-AS1抑制MDA-MB-415细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的效果;lncRNA MCF2L-AS1负向调控miR-138-5p/AnxA2轴。结论:沉默lncRNA MCF2L-AS1可能通过上调miR-138-5p来下调AnxA2的表达,进而抑制乳腺癌MDA-MB-415细胞增殖、迁移和侵袭。

lncRNA NEAT1通过抑制hsa-miR-450b-5p促进胃癌细胞中EZH2的表达与细胞的增殖和迁移能力

目的:筛选果蝇Zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因上游miRNA及lncRNA,分析其在胃癌细胞中的表达并验证其间的靶向关系,探讨它们对胃癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:通过ENCORI、miRDB和Target Scan数据库查询并分析、筛选EZH2上游miRNA(has-miR-450b-5p),ENCORI数据库和DAINA数据库筛选has-miR-450b-5p上游lncRNA(lncRNA NEAT1),预测hsa-miR-450b-5p、lncRNA NEAT1与EZH2之间的结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证hsa-miR-450b-5p与lncRNA NEAT1的结合关系。采用q PCR和WB法检测lncRNA NEAT1和EZH2在正常胃黏膜细胞(GES-1)与胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901和MKN-28)中的表达量。按转染物的不同将MGC-803和SGC-7901细胞分为hsa-miR-450b-5p-mimic组、mimicNC组、si-NEAT1组和si-NC组,转染36~48 h后qPCR法验证过表达及敲减效果;通过qPCR、WB法检测观察过表达hsa-miR-450b-5p对细胞中lncRNANEAT1和EZH2m RNA、蛋白表达的影响,以及敲减lncRNANEAT1对hsa-miR-450b-5p和EZH2mRNA表达的影响;CCK-8法、划痕愈合实验和流式细胞术分别检测敲减EZH2或敲减lncRNA NEAT1对细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。结果:生物信息学分析筛选获得EZH2上游miRNA和lncRNA为has-miR-450b-5p和lncRNA NEAT1,双荧光素酶报告基因实验验证了两者间存在靶向关系。lncRNA NEAT1和EZH2 mRNA、蛋白在胃癌细胞中均呈高表达(均P<0.05)。与mimic-NC组相比,hsa-miR-450b-5p-mimic组MGC-803、SGC-7901细胞中miR-450b-5p水平均显著升高,而EZH2 mRNA、蛋白和lncRNA NEAT1的表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01);与si-NC组相比,si-NEAT1组MGC-803、SGC-7901细胞中lncRNA NEAT1和EZH2 mRNA的表达量均显著降低(均P<0.01),SGC-7901细胞中hsa-miR-450b-5p表达量显著升高(P<0.05)。敲减EZH2或敲减lncRNA NEAT1后,MGC-803、SGC-7901细胞的增殖、迁移能力均显著降低(均P<0.01)。结论:lncRNA NEAT1和EZH2在胃癌细胞中均呈高表达,lncRNA NEAT1可通过hsa-miR-450b-5p促进EZH2的表达并提高胃癌MGC-803和SGC-7901细胞的增殖和迁移能力。

lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症中的功能

【背景】奶牛乳腺炎是奶牛中危害最严重的疾病之一,严重影响乳品质,不仅造成经济损失,甚至危及人类健康。已有研究表明,lncRNAs广泛参与人和动物的炎症和免疫调节。lncRNA RRAS2-AS1是我们在前期研究中新发现的差异表达lncRNA,其表达模式和功能尚不清楚。【目的】通过探究lncRNA RRAS2-AS1在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, bMECs)炎症反应中的作用机制,为奶牛乳腺炎的分子调控机制解析和抗乳腺炎分子选育提供理论依据。【方法】利用RT-PCR和RACE等技术进行了lncRNA RRAS2-AS1的克隆,并通过生物信息学方法进行lncRNA RRAS2-AS1的靶基因预测及功能富集分析;利用细胞免疫荧光技术鉴定bMECs,利用细胞核质分离及半定量PCR技术检测了lncRNA RRAS2-AS1的亚细胞定位情况;采用qRT-PCR检测了lncRNA RRAS2-AS1在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导bMECs炎症反应和乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达模式;利用LPS诱导bMECs构建了炎症细胞模型,在此基础上,通过lncRNA超表达、qRT-PCR和ELISA等技术研究了lncRNA RRAS2-AS1对炎性bMECs内的促炎细胞因子基因、增殖相关基因和凋亡相关基因在mRNA和(或)蛋白质水平表达的影响,同时采用EdU、CCK-8和流式细胞术进一步验证了lncRNA RRAS2-AS1对bMECs增殖、活力和凋亡的影响。【结果】lncRNA RRAS2-AS1基因的长度为363 bp,主要定位于细胞质中。表达量检测结果表明,与对照组相比,lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导炎症的bMECs和乳腺炎组织中的表达量显著下调(P<0.05);lncRNA RRAS2-AS1超表达试验结果表明,与对照组相比,lncRNA RRAS2-AS1超表达组的炎症信号通路关键基因(TLR4和NF-κB1)、促炎细胞因子基因(IL-1β、IL-6和IL-8)、促凋亡基因(BAD、CASP3和BAX等)的表达量显著下调(P<0.01),而增殖标志基因(CDK2、CDK4和PCNA)的表达量显著上调(P<0.05)。此外,lncRNA RRAS2-AS1超表达组的细胞活力显著增加(P<0.05),而bMECs的凋亡率极显著降低(P<0.01)。【结论】lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导bMECs的炎症反应和乳腺炎奶牛的乳腺组织中均显著下调;超表达lncRNA RRAS2-AS1可下调促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达,并促进细胞活力和增殖、抑制细胞凋亡,从而减轻LPS诱导的bMECs炎症反应,该结果可为解析奶牛乳腺炎的分子调控网络奠定了基础。

lncRNA PSMA3-AS1调节miR-142-3p/HMGA2轴对卵巢癌恶性进展的影响

目的:探讨lncRNA PSMA3-AS1通过调节miR-142-3p/HMGA2轴对卵巢癌恶性进展的影响及其机制。方法:选择2019年3月至2022年7月期间在本院确诊的53例卵巢癌患者作为研究对象,收集患者卵巢癌组织及癌旁组织。体外培养人正常卵巢细胞HOSEpiC和卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3、A2780、COV362,RT-qPCR检测卵巢癌细胞中lncRNA PSMA3-AS1表达,筛选最佳干预细胞系。双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA PSMA3-AS1、HMGA2与miR-142-3p的靶向关系;将SKOV3细胞分为si-NC组、si-PSMA3-AS1组、si-PSMA3-AS1+anti-miR-NC组、si-PSMA3-AS1+anti-miR-142-3p组、miR-NC组、miR-142-3p mimics组、miR-142-3p mimics+pcDNA组、miR-142-3p mimics+HMGA2组,检测细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭;Western blot检测Ki67、Cyclin D1、Bcl-2、cleaved caspase 3、HMGA2蛋白表达;小鼠移植瘤实验验证lncRNA PSMA3-AS1对卵巢癌肿瘤生长的影响。结果:与癌旁组织比较,卵巢癌组织中lncRNA PSMA3-AS1和HMGA2表达升高,miR-142-3p表达降低(P<0.05);lncRNA PSMA3-AS1和HMGA2在SKOV3细胞中表达水平最高,miR-142-3p在SKOV3细胞中表达水平最低;下拉实验和双荧光素酶报告显示,lncRNA PSMA3-AS1、HMGA2与miR-142-3p存在靶向关系;敲低lncRNA PSMA3-AS1或过表达miR-142-3p后,细胞OD值、细胞克隆数、划痕愈合率、细胞侵袭数及Ki67、Cyclin D1、Bcl-2、HMGA2表达显著降低,细胞凋亡率、cleaved caspase 3表达显著增加(P<0.05);抑制miR-142-3p表达或过表达HMGA2可逆转敲低lncRNA PSMA3-AS1或过表达miR-142-3p对卵巢癌细胞恶性行为的抑制作用;体内实验表明,敲低lncRNA PSMA3-AS1表达可抑制小鼠肿瘤生长。结论:lncRNA PSMA3-AS1在卵巢癌中高表达,敲低lncRNA PSMA3-AS1可调节miR-142-3p/HMGA2轴抑制卵巢癌恶性发展。

宫颈癌患者癌组织中lncRNA HOXA-AS2表达对患者免疫指标水平和不良生存结局的影响

目的分析宫颈癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)HOXA簇反义RNA 2(HOXA-AS2)表达对患者免疫指标水平和预后的影响。方法选取2016年1月至2017年5月于当阳市人民医院确诊为宫颈癌的95例患者作为宫颈癌(CC)组,同期40例子宫肌瘤患者作为对照组。比较两组组织(对照组为宫颈组织,CC组为宫颈癌组织)及血清HOXA-AS2水平差异。采用Pearson相关分析HOXA-AS2与宫颈癌患者免疫指标水平的相关性。Cox回归模型分析宫颈癌患者不良生存结局的影响因素。结果与对照组比较,CC组组织及血清HOXA-AS2水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。CC组患者CD8^(+)T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比、免疫抑制酸性蛋白(IAP)水平均高于对照组,而CD3^(+)T淋巴细胞百分比、CD4^(+)/CD8^(+)比值、CD4^(+)T淋巴细胞百分比均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织HOXA-AS2水平与IAP、CD8^(+)T淋巴细胞百分比、自然杀伤细胞百分比呈正相关(r=0.617、0.593、0.528,P<0.05),与CD3^(+)T淋巴细胞百分比、CD4^(+)/CD8^(+)比值、CD4^(+)T淋巴细胞百分比呈负相关(r=-0.506、-0.539、-0.482,P<0.05)。分化程度为低分化、发生淋巴结转移、FIGO分期为Ⅲ~Ⅳ期及HOXA-AS2高表达是宫颈癌患者不良生存结局的危险因素(P<0.05)。结论HOXA-AS2在宫颈癌中表达水平升高,其与宫颈癌患者免疫指标水平密切相关,是宫颈癌患者不良生存结局的危险因素。

lncRNA MIR4435-2HG靶向miR-376a-3p调控胆管癌细胞生物学行为的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)MIR4435-2HG(MIR4435-2HG)对胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其对微小RNA-376a-3p(miR-376a-3p)的调控作用。方法 qRT-PCR法检测人肝内胆管上皮细胞HIBEpic与人胆管癌细胞RBE中MIR4435-2HG、miR-376a-3p的表达。将si-NC、si-MIR4435-2HG、miR-NC、miR-376a-3p mimics、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-NC、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-376a-3p分别转染至RBE细胞,作为si-NC组、si-MIR4435-2HG组、miR-NC组、miR-376a-3p组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组;采用MTT法、Transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验验证MIR4435-2HG与miR-376a-3p的靶向关系。Western blot检测相关蛋白表达。结果 RBE细胞中MIR4435-2HG表达量升高(P<0.05),miR-376a-3p表达量降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-MIR4435-2HG组MIR4435-2HG表达、细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率升高(P<0.05)。MIR4435-2HG可靶向调控miR-376a-3p;与si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组比较,si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05),迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论 敲低MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-376a-3p进而抑制RBE细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导其凋亡。

宫颈癌患者血清lncRNA CCAT2、miR-944的表达及其临床意义

目的分析宫颈癌患者血清lncRNA CCAT2、miR-944的表达及其临床意义。方法选取120例宫颈癌患者为宫颈癌组,120例宫颈上皮瘤样病变患者为病变组,120例健康者为对照组,比较三组的血清lncRNA CCAT2、miR-944表达水平,分析二者联合检测对宫颈癌的诊断效能。结果血清lncRNA CCAT2、miR-944的表达水平由高到低依次为宫颈癌组、病变组、对照组(均P<0.05)。入院时血清lncRNA CCAT2、miR-944联合检测诊断宫颈癌的AUC为0.916,高于各指标单独检测。结论宫颈癌患者的血清lncRNA CCAT2、miR-944水平呈异常高表达,二者联合检测对宫颈癌的诊断价值较高。

灯盏花素调节lncRNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2轴抑制哮喘模型小鼠气道炎症

目的探究灯盏花素通过长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1/microRNA(miR)-9-5p/SLC26A2轴对哮喘模型小鼠气道炎症的抑制作用及分子机制。方法15只6~8周雄性C57BL/6J小鼠,按照随机数字表法分为三组,即对照组、哮喘模型组和灯盏花素组。灯盏花素组小鼠在哮喘模型构建完成后每天1次灌胃10 mg/kg灯盏花素,连续7 d;对照组及哮喘模型组则使用等体积0.9%生理盐水进行灌胃处理。采用苏木素-伊红(HE)染色和过碘酸雪夫(PAS)染色对小鼠肺组织进行组织病理学观察。采用Wright-Giemsa对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行染色及细胞学检测。酶联免疫吸附实验检测BALF及血清中炎性因子的水平。荧光原位杂交检测NEAT1的表达。实时荧光定量PCR检测lncRNA-NEAT1、miR-9-5p和SLC26A2 mRNA的表达。蛋白免疫印迹检测SLC26A2的蛋白表达。结果与对照组比较,哮喘模型组小鼠的BALF炎性细胞总数[(68.32±7.25)×10^(4)/mL比(17.71±3.14)×10^(4)/mL,P<0.01]、中性粒细胞数[(5.50±0.58)×10^(4)/mL比(0.72±0.15)×10^(4)/mL,P<0.01]、巨噬细胞数[(13.02±1.04)×10^(4)/mL比(2.70±0.61)×10^(4)/mL,P<0.01]、淋巴细胞数[(23.07±2.90)×10^(4)/mL比(4.13±0.53)×10^(4)/mL,P<0.01]、嗜酸性粒细胞数[(22.13±2.21)×10^(4)/mL比(1.63±0.22)×10^(4)/mL,P<0.01]增加;肺组织炎性细胞浸润水平增加[(2.49±0.25)分比(0.26±0.04)分,P<0.01],PAS评分升高[(2.24±0.16)分比(0.26±0.08)分,P<0.01];血清IgE[(3.52±0.32)IU/mL比(1.02±0.08)IU/mL,P<0.01]及BALF中白细胞介素-5(IL-5)[(154.48±9.27)pg/mL比(54.56±3.35)pg/mL,P<0.01]、白细胞介素-13(IL-13)[(96.86±6.45)pg/mL比(79.18±3.34)pg/mL,P<0.05]、白细胞介素-17(IL-17)[(185.24±7.24)pg/mL比(73.32±4.15)pg/mL,P<0.01]表达上升,干扰素-γ(INF-γ)表达下降[(48.46±3.81)pg/mL比(84.76±2.91)pg/mL,P<0.01]。与哮喘模型组比较,灯盏花素组小鼠BALF炎性细胞总数[(52.10±7.59)×10^(4)/mL比(68.32±7.25)×10^(4)/mL,P<0.05]、中性粒细胞数[(4.21±0.54)×10^(4)/mL比(5.50±0.58)×10^(4)/mL,P<0.05]、巨噬细胞数[(3.61±0.28)×10^(4)/mL比(13.02±1.04)×10^(4)/mL,P<0.01]、淋巴细胞数[(9.52±1.23)×10^(4)/mL比(23.07±2.90)×10^(4)/mL,P<0.01]、嗜酸性粒细胞数[(8.87±1.33)×10^(4)/mL比(22.13±2.21)×10^(4)/mL,P<0.01]降低;肺组织炎性细胞浸润水平[(1.46±0.15)分比(2.49±0.25)分,P<0.01]及PAS评分降低[(0.58±0.07)分比(2.24±0.16)分,P<0.01];血清IgE[(1.83±0.14)IU/mL比(3.52±0.32)IU/mL,P<0.01]及BALF中IL-5[(78.25±4.44)pg/mL比(154.48±9.27)pg/mL,P<0.01]、IL-13[(59.34±5.32)pg/mL比(96.86±6.45)pg/mL,P<0.01]、IL-17[(125.60±5.88)pg/mL比(185.24±7.24)pg/mL,P<0.01]表达下降,INF-γ[(65.48±4.49)pg/mL比(48.46±3.81)pg/mL,P<0.05]表达上升。与对照组比较,哮喘模型组小鼠肺组织中NEAT1[(3.96±0.32)比(1.00±0.15),P<0.01]、SLC26A2相对表达上升[(3.91±0.32)比(1.00±0.08),P<0.01],miR-9-5p相对表达量显著下降[(0.48±0.07)比(1.00±0.09),P<0.01]。与哮喘模型组比较,灯盏花素组小鼠NEAT1[(1.82±0.28)比(3.96±0.32),P<0.01]、SLC26A2相对表达降低[(2.00±0.23)比(3.91±0.32),P<0.01],miR-9-5p相对表达增加[(0.67±0.06)比(0.48±0.07),P<0.05]。结论灯盏花素可能通过调节lncRNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2轴抑制哮喘小鼠的气道炎症。

LncRNA FAM95B1调控胰岛素样生长因子2的表达对宫腔粘连发生的影响

目的探究lncRNA FAM95B1及蛋白编码基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)对宫腔粘连发生的作用,为宫腔粘连的防治提供新的分子靶点。方法在宫腔粘连组织中采用反转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测lncRNA FAM95B1的mRNA表达水平,采用Western blotting方法检测IGF2及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原蛋白(collagen type I alpha 1 chain protein,COL1A1)的蛋白表达水平。在经过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理的子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)中,采用RT-qPCR方法检测lncRNA FAM95B1、IGF2、纤维化标志物(α-SMA、COL1A1、Snail)及上皮标志蛋白E-cadherin的mRNA表达水平。在ESCs中,分别下调lncRNA FAM95B1和IGF2基因,验证二者的调控关系;免疫共沉淀实验检测lncRNA FAM95B1与IGF2的结合关系。然后,si-FAM95B1转染入ESCs中并经过TGF-β1处理,进一步探究lncRNA FAM95B1及IGF2在ESCs向成纤维细胞分化的上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用。结果宫腔粘连组织中lncRNA FAM95B1、IGF2及纤维化标志物α-SMA、COL1A1的表达水平上调;经过TGF-β1处理的ESCs中lncRNA FAM95B1、IGF2、纤维化标志物(α-SMA、COL1A1、Snail)的表达水平上调,上皮标志蛋白E-cadherin的表达水平下调。IGF2随lncRNA FAM95B1的变化而变化,而下调IGF2后,lncRNA FAM95B1的表达无明显变化,lncRNA FAM95B1正向调节IGF2;lncRNA FAM95B1与IGF2在TGF-β1处理的ESCs中结合。si-FAM95B1在ESCs向成纤维细胞分化的EMT过程中抑制IGF2的表达,发挥抗纤维化作用。结论si-FAM95B1可通过下调IGF2的表达抑制宫腔粘连的发生,lncRNA FAM95B1/IGF2轴可能为宫腔粘连的靶向治疗提供新的分子靶点。

M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1通过激活JAK2/STAT3通路促进巨噬细胞的极化

目的探究M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1对巨噬细胞极化的影响及机制。方法体外分离并培养BALB/c小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),IL-4诱导其向M2型巨噬细胞极化后,提取并鉴定M2细胞上清液所分泌的外泌体exosome(M2-exo),qRT-PCR检测M2外泌体中lncRNA的表达。将100μg/mL的M2-exo,对照组用等体积的PBS分别与M0巨噬细胞共孵育48 h后,qRT-PCR及Western blot检测各组细胞中Arg1、YM-1、FIZZ1、iNOS和TNF-α的表达,流式细胞术检测CD206^(+)细胞比例,Western blot检测各组细胞JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平。设计、合成lncRNA smart silencer特异性抑制lncRNA NR_028113.1的表达,转染M2细胞48 h后提取各组细胞(exo+NC和exo+smart silencer)上清液分泌的外泌体再与M0型巨噬细胞共孵育,检测孵育后各组细胞中Arg1、YM-1、FIZZ1、iNOS和TNF-α的表达以及CD206^(+)细胞比例和JAK2/STAT3信号通路蛋白磷酸化水平。结果lncRNA NR_028113.1在M2型巨噬细胞外泌体中高表达(P<0.05)。相比于PBS对照组,与M2-exo共培养的M0巨噬细胞中Arg1、YM-1和FIZZ1表达均显著上调(P<0.05),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.05),CD206^(+)细胞所占比例显著增加(P<0.01),JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05)。抑制M2-exo中lncRNA NR_028113.1的表达后,共培养的M0巨噬细胞中Arg1、YM-1和FIZZ1表达显著下调(P<0.05),iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.05),CD206^(+)细胞所占比例显著减少(P<0.05),JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平显著减少(P<0.05)。结论M2型巨噬细胞来源的外泌体lncRNA NR_028113.1可显著促进巨噬细胞向M2型极化,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路相关。

lncRNA CTBP1-AS2靶向miR-205-5p影响髓核细胞凋亡及炎症反应的分子机制研究

目的:探讨lncRNA CTBP1-AS2对IL-1β诱导的大鼠髓核细胞凋亡及炎症反应的影响及可能作用机制。方法:采用IL-1β诱导大鼠髓核细胞建立细胞损伤模型,随机分为:对照组、模型组、si-NC+模型组、si-lncRNA CTBP1-AS2+模型组、miR-NC+模型组、miR-205-5p+模型组、si-lncRNA CTBP1-AS2+anti-miR-NC+模型组、si-lncRNA CTBP1-AS2+anti-miR-205-5p+模型组;qRT-PCR检测lncRNA CTBP1-AS2、miR-205-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA检测TNF-α、IL-6水平;双荧光素酶报告实验检测lncRNA CTBP1-AS2与miR-205-5p的靶向关系;Western blot检测Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组lncRNA CTBP1-AS2表达、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、TNF-α、IL-6水平及细胞凋亡率均明显升高,miR-205-5p表达降低(P<0.05);与si-NC+模型组比较,si-lncRNA CTBP1-AS2+模型组细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、TNF-α、IL-6水平明显降低(P<0.05);与miR-NC+模型组比较,miR-205-5p+模型组细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、Cleavedcaspase-3、Bax蛋白水平明显降低(P<0.05);lncRNA CTBP1-AS2可负调控miR-205-5p表达;与si-lncRNA CTBP1-AS2+anti-miRNC+模型组比较,si-lncRNA CTBP1-AS2+anti-miR-205-5p+模型组细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平均明显升高(P<0.05)。结论:干扰lncRNA CTBP1-AS2表达可通过促进miR-205-5p表达抑制细胞凋亡及炎症反应,从而减轻IL-1β诱导的大鼠髓核细胞损伤。

葡萄籽提取物原花青素通过LncRNA NBR2/miR-650调节EMT抑制肝癌细胞Hep3B增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨葡萄籽提取物原花青素是否通过长链非编码RNA(LncRNA)NBR2/微小RNA(miR)-650并调节上皮间充质转化(EMT)来影响肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。方法将肝癌细胞Hep3B分为NC组(未处理),低、中、高剂量组(给予25、50、100μg/ml葡萄籽提取物原花青素),si-NC组,si-LncRNA NBR2组,si-NC+高剂量组、si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组。采用Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、EMT过程E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白表达,细胞计数试剂盒(CCK)-8、Transwell法和定量RT-PCR(qRT-PCR)分析细胞增殖、迁移、侵袭与LncRNA NBR2、miR-650的表达。双荧光素酶活性检测LncRNA NBR2和miR-650的靶向结合。结果低、中、高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移数量、侵袭数量、miR-650表达量均低于NC组,LncRNA NBR2表达量高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌细胞Hep3B细胞中E-Cadherin蛋白表达量高于NC组,N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2组的肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均比si-NC组高,差异有统计学意义(P<0.05)。si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达量、增殖能力、迁移和侵袭数量均高于si-NC+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量低于si-NC+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。LncRNA NBR2靶向调控miR-650的表达。anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高剂量组肝癌细胞Hep3B CyclinD1、MMP2、MMP9、N-Cadherin、Vimentin蛋白、LncRNA NBR2表达量及增殖能力、迁移和侵袭数量均低于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,E-Cadherin蛋白表达量高于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论葡萄籽提取物原花青素通过上调LncRNANBR2靶向下调miR-650并调节EMT,来抑制肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移和侵袭。

E2F调控lncRNA HOTAIR在高磷诱导VSMCs钙化中的作用机制研究

目的:探讨转录因子E2F调控长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA) HOTAIR在高磷(high phosphorus, HP)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)钙化中的作用及其机制。方法:体外培养人VSMCs,采用HP(10 mmol/L β-磷酸甘油酯)诱导构建VSMCs钙化模型,设置实验分组:正常对照(control)组和HP组。采用试剂盒进行钙沉积含量测定;RT-qPCR检测VSMCs中E2F mRNA、lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA的表达;Western blot检测E2F和Klotho蛋白的表达。过表达E2F,设置实验分组:control组、HP组、HP+空载(HP+Adlaz)组和HP+过表达E2F(HP+AdE2F)组。茜素红染色评估细胞钙化并进行钙沉积含量测定;RT-qPCR检测VSMCs中E2F mRNA、lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA的表达;Western blot检测E2F和Klotho蛋白的表达;双萤光素酶报告基因检测验证E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho的靶向关系。结果:与control组相比较,HP组细胞呈现明显的钙化,钙沉积含量增加;RT-qPCR显示E2F mRNA、lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA在HP组中表达下调;Western blot提示E2F和Klotho蛋白在HP组表达下调。过表达E2F后,HP+AdE2F组细胞较HP+Adlaz组减轻,钙沉积含量减少;RT-qPCR提示lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA在HP+AdE2F组中表达上调,Western blot显示E2F和Klotho蛋白在HP+AdE2F组中表达上调。双萤光素酶报告基因系统检测提示E2F的表达水平与lncRNA HOTAIR呈现显著正相关,同时表明Klotho为lncRNA HOTAIR的靶基因。结论:E2F通过调控lncRNA HOTAIR介导Klotho,从而抑制HP诱导的VSMCs钙化。

LncRNA MIR22HG调节miR-132-3p/TLR2轴对急性心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响

目的:探讨长链非编码RNA miR-22宿主基因(lncRNA MIR22HG)调节miR-132-3p/Toll样受体2(TLR2)轴对急性心肌梗死(AMI)小鼠心肌细胞凋亡和心室重构的影响。方法:取C57BL/6J小鼠随机分为sham组、AMI组、AMI+sh-NC组、AMI+shMIR22HG组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-NC组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-132-3p组,每组10只,除去sham组外,其它组都进行冠状动脉左前降支结扎,sham组只开胸不结扎冠状动脉,其中AMI+sh-NC组、AMI+sh-MIR22HG组、AMI+shMIR22HG+antagomir-NC组、AMI+sh-MIR22HG+antagomir-132-3p组小鼠分别相对应的对尾静脉注射sh-NC、sh-MIR22HG、sh-MIR22HG+antagomir-NC、sh-MIR22HG+antagomir-132-3p。超声心动图评估小鼠心室重构和心脏功能;HE染色和Masson染色观察心肌组织病理学变化及纤维化;RT-qPCR检测心肌组织MIR22HG、miR-132-3p表达;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;Western blotting检测心肌组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleved caspase-3)/半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、collagenⅢ和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;双荧光素酶报告基因实验分别验证MIR22HG和miR-132-3p、miR-132-3p和TLR2的关系。结果:与sham组比较,AMI组小鼠心功能显著降低,心肌组织损伤、心肌纤维化加重,心肌细胞凋亡率、MIR22HG、TLR2、cleved caspase-3/caspase-3、collagenⅠ、collagenⅢ和α-SMA蛋白表达水平显著升高,miR-132-3p和Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与AMI+sh-NC组比较,AMI+sh-MIR22HG组小鼠心功能改善,心肌组织损伤、心肌纤维化减轻,心肌细胞凋亡率、MIR22HG、TLR2、cleved caspase-3/caspase-3、collagenⅠ、collagenⅢ和α-SMA蛋白表达水平显著降低,miR-132-3p和Bcl-2蛋白表达上升(P<0.05);下调miR-132-3p减弱了敲减MIR22HG对心肌组织的保护作用;双荧光素酶报告基因实验结果显示,MIR22HG靶向调控miR-132-3p表达,miR-132-3p靶向负调控TLR2表达。结论:抑制MIR22HG表达可通过调节miR-132-3p/TLR2轴抑制AMI小鼠心肌细胞凋亡,改善小鼠心室重构。