LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p基因调控宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)PITPNA反义RNA 1(PITPNA-AS1)是否通过靶向miR-491-3p调控宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。方法qRT-PCR检测宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、Caski)、宫颈上皮永生化细胞H8中LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p表达。将未处理的宫颈癌细胞HeLa设为对照(NC组),并在宫颈癌细胞HeLa中转染si-NC(si-NC组)、si-LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-491-3p mimics(miR-491-3p组)、pcDNA(pcDNA组)、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1组)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-NC(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC组)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-491-3p(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p组)。Western Blot、细胞计数试剂盒8(CCK-8)法和Transwell法分别检测转染前后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9蛋白表达、细胞增殖、迁移和侵袭变化。LncBase Predicted v.2和双荧光素酶活性检测分析LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p的靶向结合。结果与宫颈上皮永生化细胞H8比较,宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、Caski中LncRNA PITPNA-AS1表达水平升高,miR-491-3p表达水平降低(P<0.05)。选择差异最显著的宫颈癌细胞HeLa进行后续研究。低表达LncRNA PITPNA-AS1或过表达miR-491-3p降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平、细胞增殖、迁移和侵袭数量(P<0.05)。LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p,并调控miR-491-3p的表达。anti-miR-491-3p逆转低表达LncRNA PITPNA-AS1对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论低表达LncRNA PITPNA-AS1通过靶向miR-491-3p基因,抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。

LncRNA PITPNA-AS1促进非小细胞肺癌增殖及抑制细胞凋亡和自噬

目的探讨长链非编码RNA PITPNA-AS1反义RNA 1(LncRNA PITPNA-AS1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达水平及作用和机制。方法收集NSCLC和癌旁组织标本,采用qRT-PCR检测LncRNA PITPNA-AS1表达;采用LncRNA PITPNA-AS1 siRNA转染NSCLC细胞,分为si-NC组和si-LncRNA PITPNA-AS1组;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡及ROS;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白caspase 3、caspase 9、Bcl-2、Bax,自噬蛋白LC3B、Atg5、Beclin-1及ERK信号通路p38、ERK蛋白表达。结果LncRNA PITPNA-AS1在NSCLC组织和细胞系中表达均上调(P<0.05)。肿瘤大小>3 cm、TNM分期Ⅲ—Ⅳ患者的LncRNA PITPNA-AS1表达量高于肿瘤大小≤3 cm、TNM分期Ⅰ—Ⅱ患者(P<0.05)。与si-NC组相比,si-LncRNA PITPNA-AS1组NSCLC细胞中LncRNA PITPNA-AS1表达显著减少、NSCLC细胞增殖能力显著降低、ROS产生增多并发生细胞凋亡和自噬,细胞中caspase 3、caspase 9、Bax、Beclin-1、LC3B、Atg5、p-p38、pERK蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少(均P<0.05)。结论LncRNA PITPNA-AS1调控ROS/ERK信号途径促进非小细胞肺癌增殖及抑制细胞凋亡和自噬。

lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-367-3p调控多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)PITPNA反义RNA 1(PITPNA-AS1)靶向miR-367-3p调控多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)测定多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1.S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p表达。在RPMI-8226细胞中转染si-NC(si-NC组)、si-lncRNA PITPNA-AS1(si-lncRNA PITPNA-AS1组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-367-3p mimics(miR-367-3p组),或同时转染anti-miR-NC与si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1组)、anti-miR-367-3p与si-lncRNA PITPNA-AS1(anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS1组),并将未转染的细胞设为对照组(NC组)。采用Western Blot、细胞计数试剂盒8(CCK-8)、细胞克隆形成实验和Transwell实验分别测定RPMI-8226细胞的基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9蛋白表达、细胞活力、克隆形成和迁移、侵袭。双荧光素酶活性检测实验分析lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的靶向关系。结果与成骨细胞MC3T3-E1比较,多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1.S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1表达量均增加,miR-367-3p的表达量均减少(P<0.05)。干扰lncRNA PITPNA-AS1或miR-367-3p高表达显著降低RPMI-8226细胞的MMP2蛋白、MMP9蛋白的表达量,并降低细胞活力、克隆形式数、迁移和侵袭数量(均P<0.05)。lncRNA PITPNA-AS1靶向调控miR-367-3p的表达。anti-miR-367-3p可以逆转干扰lncRNA PITPNA-AS1对多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭的影响。结论干扰lncRNA PITPNA-AS1通过靶向调控miR-367-3p,从而抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-92a-3p/TCF21对卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA PITPNA-AS1在卵巢癌中的作用及其可能的分子机制。方法采用荧光实时定量聚合酶链式反应(qPCR)技术检测卵巢癌组织和对应的癌旁组织、卵巢癌细胞系和正常卵巢上皮细胞系中PITPNA-AS1的表达水平。将PITPNA-AS1表达最少的细胞系分为对照组和实验组,分别转染阴性对照质粒或PITPNA-AS1质粒。细胞计数实验(CCK-8)法和Transwell法检测细胞的增殖活性和侵袭能力。生物信息学方法预测和双荧光素酶活性报告基因实验验证PITPNA-AS1作用的分子机制。qPCR和Western blot检测PITPNA-AS1相互作用的基因表达。结果PITPNA-AS1在卵巢癌组织中表达低于癌旁组织(P<0.01)。PITPNA-AS1在卵巢癌细胞系中的表达水平均低于正常卵巢上皮细胞(P<0.05),OVCAR-3细胞表达最少(P<0.01)。与对照组比较,过表达PITPNA-AS1能抑制OVCAR-3细胞的增殖活力(P<0.05)和侵袭能力(P<0.01)。PITPNA-AS1与miR-92a-3p存在靶向关系(P<0.01),miR-92a-3p与转录因子21(TCF21)存在靶向关系(P<0.01)。过表达PITPNA-AS1导致OVCAR-3细胞中miR-92a-3p的表达下降(P<0.01),TCF21基因的表达增加(P<0.01)。结论PITPNA-AS1在卵巢癌组织和细胞系中低表达,PITPNA-AS1可靶向调控miR-92a-3p/TCF21抑制卵巢癌OVCAR-3细胞的增殖和侵袭。

LncRNA FAS-AS1转染对K562细胞生物学行为的影响

目的探究LncRNA FAS-AS1对K562白血病细胞生物学行为的影响。方法取对数生长期的K562细胞培养分为空白对照组(正常培养,不做任何处理),阴性对照组(转染LncRNA FAS-AS1空质粒),实验组(Lnc RNA FAS-AS1)。MTT法检测细胞增殖情况,Western blot检测细胞中mTOR、AMPK蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组K562细胞FAS-AS1 mRNA表达显著上升(P<0.05),但空白组与阴性对照组细胞中FAS-AS1 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着培养时间的延长,实验组K562细胞的增殖率显著低于对照组(P<0.05),但空白与阴性对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组凋亡率显著高空白对照和阴性对照组(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组K562细胞AMPK蛋白表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组K562细胞中表达水平蛋白mTOR、AMPK比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论LncRNA FAS-AS1过表达对K562白血病细胞的生物学行为有显著影响,能够降低细胞的增殖数量及增殖活性,可能与活化AMPK基因进而阻断mTOR活性相关。

敲降lncRNA UCA1降低人膀胱癌细胞系T24对吉西他滨耐药

目的探讨lncRNA UCA1对人膀胱癌细胞系T24体外对吉西他滨(GEM)耐药的影响及相关分子机制。方法用RT-qPCR检测T24细胞和T24/GEM细胞中UCA1 mRNA表达。用不同浓度GEM(0.1、1和10μmol/L)刺激T24/GEM细胞48 h,用LC3染色法观察自噬斑,Western blot检测自噬相关蛋白质表达。将UCA1-shRNA或UCA1-shRNA+pcDNA-Bcl-2转入T24/GEM细胞,用MTT法和流式细胞测量术评估细胞对GEM的敏感性;用Western blot检测p53、Bcl-2和自噬相关蛋白质的表达。结果T24/GEM细胞中UCA1的表达显著高于亲本T24细胞(P<0.05)。在0~10μmol/L浓度范围的GEM呈依赖性促进T24/GEM细胞自噬(P<0.05)。敲降UCA1后,T24/GEM细胞对GEM的敏感性增加(P<0.05),自噬能力减弱(P<0.05),p53和Bcl-2表达降低(P<0.05)。Bcl-2过表达能部分逆转UCA1-shRNA对T24/GEM细胞的GEM增敏和抑制自噬的作用(P<0.05)。结论敲降lncRNA UCA1通过抑制Bcl-2介导的自噬降低T24/GEM细胞对GEM的耐药性。

lncRNA LUCAT1调控AREG的表达促进宫腔粘连的发生

目的探讨lncRNA LUCAT1通过调控双调蛋白(amphiregulin,AREG)对宫腔粘连发生的作用,为宫腔粘连的防治提供新的分子靶点。方法在宫腔粘连组织和经过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理的子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cell,ESC)中采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测lncRNA LUCAT1、AREG及纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1 chain protein,COL1A1)的mRNA表达水平,采用Western blot法检测AREG、α-SMA、COL1A1的蛋白表达水平。si-LUCAT1、pcDNA LUCAT1、si-AREG分别转染ESC,RT-qPCR方法进一步检测lncRNA LUCAT1和AREG的mRNA表达水平。然后,si-LUCAT1和pcDNA LUCAT1分别转染入ESC中并经过TGF-β1处理48h,采用Western blot法进一步检测AREG、α-SMA、COL1A1的蛋白表达水平,细胞增殖实验和细胞凋亡实验检测细胞增殖率和细胞凋亡率。结果宫腔粘连组织和经TGF-β1处理的ESC中lncRNA LUCAT1、AREG及纤维化标志物α-SMA、COL1A1的表达水平上调。AREG随lncRNA LUCAT1的变化而变化,而下调AREG后lncRNA LUCAT1的表达无明显变化,lncRNA LUCAT1正向调节AREG。在ESC向成纤维细胞转化过程中,si-LUCAT1显著抑制AREG、α-SMA、COL1A1的蛋白表达水平,抑制细胞增殖促进细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.01);pcDNA LUCAT1显著诱导AREG、α-SMA、COL1A1的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)。结论lncRNA LUCAT1通过上调AREG的表达促进宫腔粘连的发生。lncRNA LUCAT1/AREG轴可能为宫腔粘连的防治提供新的分子靶点。

lncRNA PVT1对急性髓系白血病HL-60细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨长链非编码RNA PVT1基因(lncRNA PVT1)对人急性髓系白血病(AML)HL-60细胞增殖、凋亡的影响。方法 选取106例AML患者为试验组,同期健康体检志愿者100例为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测外周血lncRNA PVT1表达。以干扰lncRNA PVT1的质粒转染HL-60细胞株(si-lncRNA PVT1组),同时将转染空载体的HL-60细胞设为对照组(si-Control组),另设正常组。RT-qPCR技术检测细胞中lncRNA PVT1的表达;CCK-8检测细胞的增殖率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化;Western blot和RT-qPCR技术检测细胞中细胞周期相关蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase 3)表达。结果 试验组患者lncRNA PVT1表达水平高于对照组(P<0.05)。干扰lncRNA表达后HL-60细胞中,si-lncRNA PVT1组lncRNA PVT1水平显著低于si-Control组(P<0.05)。si-lncRNA PVT1组细胞增殖率显著低于si-Control组(P<0.05)。敲低lncRNA PVT1后细胞被显著阻滞于G1期,且明显诱导细胞的凋亡(P<0.05)。si-lncRNA PVT1组与si-Control组比较,Cyclin D1、Bcl-2表达降低,P21、Bax、Caspase 3表达升高(P<0.05)。结论 敲低lncRNA PVT1可抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,提示lncRNA PVT1可能作为AML防治的一个分子靶点。

滋金补水膏对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的治疗作用及对lncRNAPVT1、miR-30b-5p表达的影响

【目的】探讨滋金补水膏对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的治疗作用及机制。【方法】将96只大鼠随机分为正常组,模型组,滋金补水膏低、中、高剂量组,盐酸氨溴索组、滋金补水膏高剂量+pcDNA组,滋金补水膏高剂量+pcDNA-人浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)组,每组12只。除正常组外,其他各组大鼠采用气道滴注脂多糖(LPS)联合烟雾暴露法构建COPD模型。建模成功后,进行给药干预。给药结束后,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;流式细胞术检测大鼠外周血中辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)水平,苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理变化,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测血清和肺组织中长链非编码RNA(lncRNA)PVT1、miR-30b-5p表达,Western Blot法检测肺组织中维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、叉头框蛋白P3(Foxp3)蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA PVT1与miR-30b-5p的关系。【结果】与正常组比较,模型组肺泡间隔变大,支气管周围有大量炎症细胞浸润,Treg细胞比例、miR-30b-5p表达水平、Foxp3蛋白表达水平降低,IL-6、TNF-α水平,Th17细胞比例、Th17/Treg比值,lncRNA PVT1表达水平,RORγt蛋白表达水平升高(均P<0.05);与模型组比较,滋金补水膏低、中、高剂量组及盐酸氨溴索组大鼠肺组织病理损伤减轻、Treg细胞比例、miR-30b-5p表达水平、Foxp3蛋白表达水平升高,IL-6、TNF-α水平,Th17细胞比例,Th17/Treg比值,lncRNA PVT1表达水平,RORγt蛋白表达水平降低(均P<0.05)。lncRNA PVT1靶向调控miR-30b-5p表达。【结论】滋金补水膏可能通过调节lncRNA PVT1/miR-30b-5p轴促进Th17/Treg细胞平衡来抑制COPD大鼠炎症反应。

LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究长链非编码RNA(PURPL)调节微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:细胞实验:将si-NC、si-PURPL、si-PURPL+inhibitor NC、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor分别转染至肝癌细胞Huh-7细胞并命名为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,未做任何处理的Huh-7细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1的关系;qRT-PCR检测人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Huh-7中LncRNA PURPL、miR-342-3p表达;Western blot检测L02细胞、Huh-7细胞PIK3R1蛋白水平;MTT法检测Huh-7细胞增殖情况;流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率;Transwell检测Huh-7细胞侵袭数量;划痕试验测定Huh-7细胞迁移。体内实验:构建裸鼠异种移植模型,分组同细胞实验,检测肿瘤体积和肿瘤重量。结果:细胞实验结果显示:与si-NC组相比,si-PURPL组Huh-7细胞OD490值、划痕愈合率、侵袭细胞数量、LncRNA PURPL、PIK3R1水平显著下降(P<0.05),Huh-7细胞凋亡率、miR-342-3p相对表达量显著升高(P<0.05),而抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的效果;LncRNA PURPL负向调控miR-342-3p/PIK3R1轴。体内结果显示:si-PURPL组裸鼠肿瘤体积和质量较si-NC组下降(P<0.05);抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL对体内肿瘤生长的抑制作用。结论:沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7细胞的恶性生物学行为,其机制可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。

LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中的作用及其机制研究

目的探索LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中的功能及可能的机制。方法原位杂交和免疫组织化学分别检测ZEB2-AS1和ZEB2在卵巢癌组织中的表达;建立ZEB2-AS1的过表达和沉默SKOV3细胞模型;CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡和周期;细胞免疫荧光和Western blotting检测上皮-间充质相互作用(EMT)相关蛋白的表达;双萤光素酶基因报告实验检测ZEB2-AS1与ZEB2、microRNA-145(miR-145)的结合关系。结果ZEB2-AS1和ZEB2均表达于卵巢癌组织中的细胞质和细胞核;相比SKOV3细胞,ZEB2-AS1过表达的SKOV3细胞增殖能力增强(P<0.05),凋亡能力减弱(P<0.05),侵袭和迁移能力增强(P<0.05),S期细胞数增加(P<0.05),G1期细胞数减少(P<0.05);EMT相关蛋白E-cadherin相对表达量降低(P<0.05),N-cadherin和Vimentin相对表达量升高(P<0.05);而ZEB2-AS1沉默的SKOV3细胞则相反。双萤光素酶报告实验结果证实,ZEB2-AS1和miR-145具有结合关系,ZEB2-AS1与ZEB2 mRNA具有结合关系。结论LncRNA ZEB2-AS1联合亲本基因ZEB2在卵巢癌SKOV3细胞中发挥促EMT的功能作用。

lncRNA NEAT1通过Klotho/mTOR轴调控慢性脑低灌注大鼠的认知障碍

目的 探讨长链非编码RNA (lncRNA)核富集丰度转录物1 (NEAT1)对慢性脑低灌注(CCH)大鼠认知障碍的调控作用和潜在机制。方法双侧颈总动脉闭塞术(BCCAO)诱导CCH模型大鼠。将大鼠分为5组(每组n=10):Ⅰ组(假手术组);Ⅱ组(BCCAO手术组);Ⅲ组[BCCAO后于海马区注射0.3 mg·kg^(-1)·w^(-1)的沉默lncRNA NEAT1的短发夹RNA重组质粒(shNEAT1),持续12 w];Ⅳ组[BCCAO后于海马区每周注射0.3 mg·kg^(-1)·w^(-1)的shNEAT1和50 mg·kg^(-1)·w^(-1)的沉默克洛托蛋白(Klotho)的短发夹RNA重组质粒(shKlotho),持续12 w];V组[BCCAO后于海马区注射0.3 mg·kg^(-1)·w^(-1)的shNEAT1和25mg·kg^(-1)哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制剂(AZD-8055),持续12w]。行Morris水迷宫实验记录逃避潜伏期。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测lncRNA NEAT1的表达。Western blot法检测Klotho、mTOR、磷酸化的mTOR (p-mTOR)、神经核抗原(NeuN)、多聚腺苷酸核糖聚合酶(PARP)、半胱天冬酶-3(caspase-3)、切割模式的半胱天冬酶-3(cleaved-caspase-3)的表达。免疫荧光化学检测海马区NeuN阳性细胞数。结果 与Ⅰ组比,Ⅱ组大鼠的逃避潜伏期延长,lncRNA NEAT1、PARP、cleaved-caspase-3的表达均上调,NeuN、Klotho和p-mTOR的表达均下调,NeuN阳性的细胞数减少(~均P<0.05)。与Ⅱ组比,Ⅲ组大鼠的逃避潜伏期缩短,且海马组织中lncRNA NEAT1、PARP、cleaved-caspase-3的表达均下调,NeuN、Klotho和p-mTOR的表达均上调,NeuN阳性的细胞数增加(~均P><0.05)。与Ⅲ组比,Ⅳ组和Ⅴ组中大鼠的逃避潜伏期延长,且海马组织中PARP、cleaved-caspase-3的表达均上调,NeuN、Klotho和p-mTOR的表达均下调,NeuN阳性细胞数都减少(~均P <0.05)。结论 lncRNA NEAT1通过负调控Klotho/mTOR轴促进CCH大鼠的认知障碍,为研究CCH的有效治疗靶点提供理论依据。

LncRNA NORAD通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达。体外分离培养人VSMC,随机分为对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控。结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡。

LncRNA HCG18通过靶向miR-140-3p/PD-L1通路对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨长非编码(lncRNA)HCG18通过微小RNA-140-3p(miR-140-3p)/程序性死亡受体配体1(PD-L1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法 选择人鼻咽癌CNE2细胞、人正常鼻黏膜上皮细胞HNEpC细胞,将CNE2细胞分为HCG18组、pcDNA3.1组、sh-HCG18组、sh-NC组、miR-140-3p组、miR-NC组、miR-140-3p inhibitor组、Scramble组、HCG18+miR-NC组、HCG18+miR-140-3p组、miR-140-3p inhibitor+sh-NC组及miR-140-3p inhibitor+sh-PD-L1组。用CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测PD-L1蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1 mRNA水平,生物信息学、双荧光素酶报告实验分析lncRNA HCG18、miR-140-3p及PD-L1的靶向关系。结果 CNE2细胞lncRNA HCG18、PD-L1蛋白及其mRNA表达水平高于HNEpC细胞,miR-140-3p表达水平低于HNEpC细胞(P <0.05)。上调lncRNA HCG18或下调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力增强,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平升高(P <0.05);下调lncRNA HCG18或上调miR-140-3p后CNE2细胞增殖、细胞迁移与侵袭能力降低,PD-L1蛋白、PD-L1 mRNA水平降低(P <0.05)。miR-140-3p与lncRNA HCG18、PD-L1均有靶向关系。上调miR-140-3p表达可逆转上调lncRNA HCG18对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用;沉默PD-L1可逆转下调miR-140-3p对CNE2细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用。结论 过表达lncRNA HCG18可通过海绵化miR-140-3p,上调PD-L1表达,促进CNE2细胞增殖、迁移与侵袭。

咪达唑仑通过调控LncRNA NR2F2-AS1对肾癌786-O细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 探讨咪达唑仑对肾癌786-O细胞增殖、迁移及凋亡的影响及其可能作用机制。方法 体外培养人肾癌细胞786-O,随机分组:咪达唑仑0、20、40、60μmol/L组、si-NC组、si-核受体亚家族2组F成员反义RNA(NR2F2-AS)1组、咪达唑仑+pcDNA组、咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组;CCK-8法、流式细胞术与Transwell实验分别检测细胞增殖、凋亡及迁移;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA NR2F2-AS1表达量;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关蛋白(Bax)表达量。结果 与咪达唑仑0μmol/L组比较,咪达唑仑20、40、60μmol/L组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平明显升高,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显降低,长链非编码(Lnc)RNA NR2F2-AS1表达量明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);转染si-NR2F2-AS1可明显抑制细胞增殖及迁移,并可明显提高细胞凋亡率(P<0.05);与咪达唑仑+pcDNA组比较,咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平明显降低,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论 咪达唑仑可通过抑制LncRNA NR2F2-AS1表达而减弱肾癌细胞增殖及迁移能力,并可诱导肾癌细胞凋亡。

沉默lncRNA MCF2L-AS1通过miR-138-5p/AnxA2轴抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探究lncRNA MCF2L-AS1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响与机制。方法:qRT-PCR检测正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系(MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231)中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p水平;将si-NC、si-MCF2L-AS1、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor分别转染至MDA-MB-415细胞并命名为si-NC组、si-MCF2L-AS1组、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC组、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor组,未做任何处理的MDA-MB-415细胞记为NC组。qRT-PCR检测MDA-MB-415细胞中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p表达;MTT法检测MDA-MB-415细胞增殖情况;流式细胞术检测MDA-MB-415细胞凋亡率;Transwell检测MDA-MB-415细胞侵袭、迁移数量;Western blot检测MDA-MB-415细胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、AnxA2蛋白水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、AnxA2的关系;小鼠异种移植实验检测肿瘤生长。结果:与MCF-10A细胞相比,MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231细胞中lncRNA MCF2L-AS1、AnxA2水平显著上调(P<0.05),miR-138-5p表达显著下调(P<0.05)。与NC组、si-NC组相比,si-MCF2L-AS1组MDA-MB-415细胞OD 560 nm值、迁移、侵袭细胞数量、lncRNA MCF2L-AS1表达、N-cadherin、Vimentin蛋白水平、小鼠肿瘤体积、肿瘤质量显著下降(P<0.05),MDA-MB-415细胞凋亡率、miR-138-5p表达、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);而抑制miR-138-5p表达减弱了沉默lncRNA MCF2L-AS1抑制MDA-MB-415细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的效果;lncRNA MCF2L-AS1负向调控miR-138-5p/AnxA2轴。结论:沉默lncRNA MCF2L-AS1可能通过上调miR-138-5p来下调AnxA2的表达,进而抑制乳腺癌MDA-MB-415细胞增殖、迁移和侵袭。

LncRNA MAFG-AS1:恶性肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点

长链非编码RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)在肿瘤发展中的调控作用已引起广泛关注。LncRNA MAFG-AS1是一种新型的致癌长链非编码RNA,在肺癌、乳腺癌和肝细胞癌等多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等恶性行为密切相关。此外,大量证据表明,LncRNA MAFG-AS1的上调与肿瘤患者的临床病理分期和不良生存预后有关。本文系统总结了近年来LncRNA MAFG-AS1在各种肿瘤中的表达、生物学功能、分子机制和临床意义的研究,并强调了LncRNA MAFG-AS1可作为新型诊断、预后生物标志物,以及癌症治疗的重要靶标。

丹蛭降糖胶囊通过LncRNA TUG1/β-catenin信号通路保护线粒体功能减轻血管钙化的机制

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)成骨样分化是血管钙化(vascular calcification,VC)细胞学基础。线粒体功能障碍在VSMCs成骨样转化中起重要作用。本研究旨在探讨丹蛭降糖胶囊(Danzhi Jiangtang capsules,DJC)通过调节LncRNA TUG1/β-catenin信号通路保护VSMCs线粒体功能减轻血管钙化的机制。方法使用β-甘油磷酸盐来诱导血管平滑肌细胞的钙化模型,并采用维生素D 3+高脂饲料来诱导糖尿病大鼠的血管钙化模型。Von Kossa染色检测细胞和血管组织钙化;用邻甲酚酞络合物比色法测定钙含量;采用对硝基苯磷酸盐比色法测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;采用RT-qPCR分析VSMCs成骨样转化相关基因骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein2,BMP2)、平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin alpha,ɑ-SMA)及长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(long noncoding RNA taurine up-regulated1,LncRNA TUG1)、β-连环蛋白(β-catenin)表达;Western blot分析BMP2、ɑ-SMA及β-catenin的蛋白表达;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;透射电镜观察线粒体结构。结果DJC降低β-甘油磷酸盐诱导的VSMCs中LncRNA TUG1的表达,下调β-catenin的表达,降低ALP活性和钙沉积,保护线粒体功能,恢复膜电位,减少VSMCs成骨样转化。重要的是,DJC通过下调糖尿病下肢血管组织LncRNA TUG1、β-catenin的表达,上调ɑ-SMA的表达来减轻糖尿病下肢VC。结论DJC对糖尿病下肢VC有明显的改善作用,机制是通过LncRNA TUG1/β-catenin信号保护线粒体功能减少VSMCs成骨细胞转化。

ODC1基因对前列腺癌细胞PC-3 LncRNA表达影响的初步观察与分析

目的探讨鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)基因对前列腺癌细胞PC-3 LncRNA表达的影响,为进一步研究其作用及调控机制提供一些实验基础和线索。方法以前列腺癌细胞PC-3作为研究对象,敲低ODC1基因,经q-PCR检测及WB检测验证后采用Illumina Novaseq 6000,PE150模式进行高通量测序,测序结果应用编码潜能分析方法(CPC分析、CNCI分析、CPAT分析、LGC分析)进行预测筛选,对筛选出的lncRNAs行差异分析、顺式作用元件分析以及GO和KEGG富集分析。再选择文献报道中与前列腺癌关系密切的几个功能lncRNAs,采用q-PCR进行验证。结果(1)在ODC1敲低PC-3细胞中筛选到341个lncRNA,差异表达的lncRNA中上调154个,下调128个。符合条件的差异lncRNA与差异表达基因共表达的顺式调控靶标有38个。(2)差异表达lncRNAs行GO和KEGG富集分析显示,lncRNA靶标基因参与体内多种生物学通路,如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt信号通路)、Ras信号通路等,还与肿瘤血管生成、细胞群增殖、正调控细胞分裂等密切相关。(3)q-PCR法验证结果:LINC00973、TERC表达显著下调、LINC00638表达显著上调,与GO和KEGG富集分析得到的lncRNA差异表达情况一致。结论敲低ODC1基因可导致PC-3细胞lncRNAs差异表达,ODC1基因有可能通过lncRNAs影响细胞信号通路,促进肿瘤的发生发展。本实验为进一步研究ODC1基因在前列腺癌中的作用提供了一些新的实验基础。

lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症中的功能

【背景】奶牛乳腺炎是奶牛中危害最严重的疾病之一,严重影响乳品质,不仅造成经济损失,甚至危及人类健康。已有研究表明,lncRNAs广泛参与人和动物的炎症和免疫调节。lncRNA RRAS2-AS1是我们在前期研究中新发现的差异表达lncRNA,其表达模式和功能尚不清楚。【目的】通过探究lncRNA RRAS2-AS1在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells, bMECs)炎症反应中的作用机制,为奶牛乳腺炎的分子调控机制解析和抗乳腺炎分子选育提供理论依据。【方法】利用RT-PCR和RACE等技术进行了lncRNA RRAS2-AS1的克隆,并通过生物信息学方法进行lncRNA RRAS2-AS1的靶基因预测及功能富集分析;利用细胞免疫荧光技术鉴定bMECs,利用细胞核质分离及半定量PCR技术检测了lncRNA RRAS2-AS1的亚细胞定位情况;采用qRT-PCR检测了lncRNA RRAS2-AS1在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导bMECs炎症反应和乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达模式;利用LPS诱导bMECs构建了炎症细胞模型,在此基础上,通过lncRNA超表达、qRT-PCR和ELISA等技术研究了lncRNA RRAS2-AS1对炎性bMECs内的促炎细胞因子基因、增殖相关基因和凋亡相关基因在mRNA和(或)蛋白质水平表达的影响,同时采用EdU、CCK-8和流式细胞术进一步验证了lncRNA RRAS2-AS1对bMECs增殖、活力和凋亡的影响。【结果】lncRNA RRAS2-AS1基因的长度为363 bp,主要定位于细胞质中。表达量检测结果表明,与对照组相比,lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导炎症的bMECs和乳腺炎组织中的表达量显著下调(P<0.05);lncRNA RRAS2-AS1超表达试验结果表明,与对照组相比,lncRNA RRAS2-AS1超表达组的炎症信号通路关键基因(TLR4和NF-κB1)、促炎细胞因子基因(IL-1β、IL-6和IL-8)、促凋亡基因(BAD、CASP3和BAX等)的表达量显著下调(P<0.01),而增殖标志基因(CDK2、CDK4和PCNA)的表达量显著上调(P<0.05)。此外,lncRNA RRAS2-AS1超表达组的细胞活力显著增加(P<0.05),而bMECs的凋亡率极显著降低(P<0.01)。【结论】lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导bMECs的炎症反应和乳腺炎奶牛的乳腺组织中均显著下调;超表达lncRNA RRAS2-AS1可下调促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达,并促进细胞活力和增殖、抑制细胞凋亡,从而减轻LPS诱导的bMECs炎症反应,该结果可为解析奶牛乳腺炎的分子调控网络奠定了基础。