lncRNA RPL34-AS1调控miR-670-5p/SMAD4对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨lncRNA RPL34-AS1对胃癌细胞生物学行为的影响及其对miR-670-5p/SMAD4分子轴的调控作用。方法回顾性收集2018年5月至2019年6月期间临沂市肿瘤医院收治的33例胃癌患者的癌组织及其癌旁组织标本。QRT-PCR检测RPL34-AS1、miR-670-5p的表达量,蛋白质印迹法检测SMAD4表达。体外培养人胃癌细胞HGC-27,实验分组:pcDNA组(转染RPL34-AS1过表达载体的阴性对照)、pcDNA-RPL34-AS1组(转染RPL34-AS1过表达载体)、anti-miR-NC组(转染miR-670-5p特异性寡核苷酸抑制剂的阴性对照)、anti-miR-670-5p组(转染miR-670-5p特异性寡核苷酸抑制剂)、pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC组(共转染pcDNA-RPL34-AS1与阴性对照mimic NC序列)、pcDNA-RPL34-AS1+miR-670-5p组(共转染pcDNA-RPL34-AS1与miR-670-5p寡核苷酸模拟物)。MTT与平板克隆形成实验检测细胞增殖与克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡率,划痕实验与Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告基因实验检测RPL34-AS1与miR-670-5p的靶向关系,以及miR-670-5p与SMAD4的靶向关系。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中RPL34-AS1和SMAD4的表达量降低,miR-670-5p的表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。过表达RPL34-AS1或抑制miR-670-5p表达后,SMAD4表达量升高,细胞活力降低,集落形成数和侵袭细胞数减少,迁移距离减小,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RPL34-AS1可靶向调控miR-670-5p,miR-670-5p可靶向调控SMAD4;而miR-670-5p过表达可逆转RPL34-AS1过表达对细胞生物学行为的作用。结论LncRNA RPL34-AS1过表达可通过调控miR-670-5p/SMAD4而抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及诱导细胞凋亡。

lncRNA RPL34-AS1通过靶向调控miR-575表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的探究RPL34-AS1对卵巢癌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制。方法取对数生长期SKOV3细胞用无血清培养基同步化12 h,将pcDNA、pcDNA-RPL34-AS1、si-NC、si-RPL34-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-575转染至SKOV3细胞中,分别记为pcDNA组、pcDNA-RPL34-AS1组、si-NC组、si-RPL34-AS1组、anti-miR-NC组、anti-miR-575组;将pcDNA-RPL34-AS1与miR-NC、miR-575分别共转染至SKOV3细胞中,记为pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC组、pcDNA-RPL34-AS1+miR-575组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测临床组织标本及转染后各组细胞中RPL34-AS1和miR-575的表达水平;双荧光素酶报告实验检测RPL34-AS1和miR-575的靶向关系;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果与癌旁组织相比,卵巢癌组织中RPL34-AS1表达水平降低(1.00±0.08比0.47±0.05),miR-575表达水平升高(1.01±0.07比3.12±0.28)(P<0.05)。转染si-RPL34-AS1后,细胞活性升高(48 h:0.68±0.06比0.55±0.05;72 h:0.99±0.08比0.71±0.06),G1期细胞所占比例降低(13.42±1.38比32.15±2.11),S期细胞所占比例升高(53.75±5.22比34.69±3.41),细胞凋亡率降低(4.31±0.42比9.25±0.91),CyclinD1、Bcl-2表达水平升高(0.92±0.08比0.71±0.07;0.86±0.07比0.61±0.06),p21、Bax表达水平降低(0.13±0.02比0.29±0.03;0.19±0.02比0.31±0.03)(P均<0.05)。RPL34-AS1靶向调控miR-575,过表达RPL34-AS1或抑制miR-575后可抑制细胞活性,阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。miR-575过表达逆转了RPL34-AS1过表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制和凋亡促进的作用。结论过表达RPL34-AS1可抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与下调miR-575有关。

糖酵解参与的黑色素瘤细胞放射敏感性lncRNAs的初步筛选及相关性分析

目的:通过微阵列芯片技术筛选糖酵解参与的黑色素瘤细胞放射治疗(以下简称放疗)敏感性相关的lncRNA和mRNA表达谱,初步探索lncRNA调控糖酵解途径影响黑色素瘤细胞放疗敏感性的分子机制。方法:以不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00 mmol/L)的2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)处理、不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)的X射线照射黑色素瘤细胞WM35。采用MTT法检测NC-0 Gy组(阴性对照组)、NC-4 Gy组(仅4 Gy X射线照射)、2-DG组(仅2.50 mmol/L 2-DG处理)、2-DG-4 Gy组(2.50 mmol/L 2-DG处理,4 Gy X射线照射)增殖能力;lncRNA和mRNA表达谱微阵列芯片检测NC-4 Gy组和2-DG-4 Gy组的lncRNA和mRNA表达谱的改变。采用CNC(coding-noncoding)分析预测表达最显著的10个lncRNA潜在靶基因,构建差异lncRNA和mRNA共表达网络。运用基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和KEGG(Kyoto EncyclopediaofGenesandGenomes)通路富集分析预测差异表达的lncRNA的功能分布;real-time RT-PCR定量检测差异表达上调最显著的5个和下调最显著的5个lncRNA的表达。结果:2-DG处理WM35细胞48和96 h,细胞增殖均受到明显抑制(均P<0.05),呈剂量依赖关系;大剂量X射线照射抑制WM35细胞的增殖,造成细胞大量死亡,4 Gy X射线照射后细胞增殖活性较阴性对照组下降61%;对NC-4 Gy组和2-DG-4 Gy组行lncRNA芯片分析,发现有1206个lncRNA和543个mRNA差异表达,real-time RT-PCR示lncRNA的变化与mRNA芯片基本一致;进一步CNC分析示这10个表达最显著的lncRNA与333个靶基因之间存在正/负相关,GO功能富集分析结果显示lncRNA主要富集于DNA结合、DNA损伤和修复、细胞周期阻滞、氧化应激等功能,KEGG通路富集分析结果显示这10个lnRNA主要与放疗敏感性相关。结论:采用微阵列芯片技术筛选出糖酵解参与的黑色素瘤细胞放疗敏感性相关的差异表达lncRNA,lncRNA RPL34-AS1可能是黑色素瘤放疗潜在的生物靶点。