IL-12和IL-6与实验性急性坏死性胰腺炎严重程度的关系

目的:探讨血清白介素12(IL-12)浓度在急性坏死性胰腺炎(ANP)中的变化以及他与胰腺病变严重程度的关系. 方法:SD大鼠92只随机分为3组,胰腺炎组(A组, n=36)和干预组(Ⅰ组,n=32)大鼠都分3次60 g/L左旋精氨酸(L-arginine)ip建立ANP大鼠模型;Ⅰ组在诱导胰腺炎后2,5,8 h分3次ip IL-10各10 000 U.正常对照组(C组,n=24)接受同剂量的生理盐水.于4, 12,24,36 h分批处死大鼠,光镜下观察胰腺组织并进行病理评分,用酶底物法检测血清淀粉酶,用ELISA法检测IL-12和IL-6浓度. 结果:A组胰腺病理评分、血清淀粉酶、IL-12及IL-6 的水平显著高于对照组(24 h,血清淀粉酶:3 264.89±1 627.18 vs 364.61±64.24,P<0.01;IL-12:104.68±23.93 vs 56.72±22.67 pg/L,P<0.01:IL-6:132.95±26.64 vs 81.90±9.93 pg/L,P<0.01),Ⅰ组可使各观察指标较A组明显下降(24 h,病理评分:4.75±1.75 vs 7.89±1.17,P<0.01;血清淀粉酶:1481.13±336.48 vs 3 264.89±1 627.18,P<0.01:IL-12:81.31±17.23 vs 1 04.68±23.93 pg/L,P<0.05;IL-6:96.80±1 8.28 vs 1 32.95±26.64 pg/L,P<0.01);IL-12与病理评分(r=0.603, P<0.001)及血清淀粉酶水平(r=0.323,P<0.05)存在正相关,但是与IL-6无显著相关性(P>0.05). 结论:大剂量L-arginine ip诱导的ANP大鼠中,血清IL-12及IL-6显著上升,应用IL-10可减轻胰腺病变程度,IL-12浓度与胰腺病变正相关.

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。

调节性树突状细胞对哮喘小鼠气道炎症及白介素12和IgE表达的影响

目的用肺脏基质细胞培养上清液与成熟树突状细胞(mDC)共培养得到的调节性树突状细胞(rDC)回输小鼠,观察其对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用及对白介素12(IL-12)、IgE表达的影响。探讨rDC诱导免疫耐受的可能机制,为临床防治哮喘提供新的思路。方法制备C57BL/6小鼠rDC。将40只C57BL/6小鼠分4组,每组10只。分别为正常组、卵清蛋白(OVA)组、mDC组、rDC组。第21天处理全部小鼠,观察各组小鼠肺组织病理学改变,血清及肺泡灌洗液中IL-12及血清IgE的表达。结果 rDC回输后可减轻肺部炎症表现,4组小鼠血清中IL-12、IgE比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。其中rDC组血清中IL-12的水平高于OVA组,IgE低于OVA组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论回输rDC可在一定程度上缓解哮喘小鼠气道的过敏性炎症反应,与上调Th1型细胞因子IL-12、下调IgE的表达有关。

重组IL-12表达载体构建及对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的调节与免疫应答影响

目的:构建携带IL-12重组基因的真核表达载体,探讨其对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的免疫调节作用及其可能机制。方法:PCR扩增mIL-12基因cDNA,利用DNA重组技术将线性化片段定向插入载体pcDNA3.1(+)质粒中,经酶切和测序鉴定,通过脂质体介导瞬时转染P815细胞,观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位。以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立妊娠期哮喘小鼠模型,通过气道内灌注:妊娠期哮喘(AP)+pcDNA3.1(+)-mIL-12组(AP1组)、单纯哮喘(ANP)+pcD-NA3.1(+)-mIL-12组(ANP1组)给予50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/脂质体混合液;AP+pcDNA3.1(+)组(AP2组)、ANP+pcDNA3.1(+)组(ANP2组)给予50μl pcDNA3.1(+)/脂质体混合液;单纯妊娠组(HP组)、阴性对照组(HNP组)给予50μlPBS。于末次激发24小时后,观察肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞计数及肺组织HE染色以评价小鼠气道炎症程度;RT-PCR、Western blot鉴定小鼠肺组织匀浆中IL-12蛋白及mRNA表达;流式细胞术检测小鼠脾细胞IL-17+及IFN-γ+分泌水平;ELISA测定小鼠外周血上清中细胞因子含量变化。结果:成功构建重组pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达载体,并在P815细胞中获得高效表达。与HP、HNP组相比,AP1、ANP1组BALF中白细胞总数及Eos,Neu,Lym占细胞总数百分比均显著低于AP2、ANP2组,但高于HP和HNP组,AP1与ANP1组间尤以AP1组降低显著(P<0.05),且肺组织炎症细胞浸润明显减轻,炎症反应明显轻微。肺组织标本中,AP1、ANP1组IL-12蛋白含量及mRNA表达水平在重组质粒干预后显著高于AP2、ANP2组。脾组织标本中AP1、ANP1组IFN-γ+含量明显升高,而CD4+IL-17+明显降低(P<0.05);IFN-γ+与CD4+IL-17+比例高于AP2、ANP2组(P<0.05);此变化趋势AP1组比ANP1组更为明显(P<0.05);HP组IFN-γ+及IL-17+含量变化与HNP组组间差异不显著。外周血上清中细胞因子检测结果 AP1、ANP1组IFN-γ明显升高,IL-4、IL-17显著降低(P<0.05)。结论:构建的pcD-NA3.1(+)-mIL-12真核表达载体能够在明显改善妊娠期哮喘小鼠气道炎症反应的同时上调IFN-γ表达,使Th2、Th17型细胞分化和增殖功能受抑,证实IL-12表达上调参与了妊娠期哮喘的发生发展。

哮喘和过敏性肺炎患者肺泡巨噬细胞释放白细胞介素-12的差异及意义

目的 :观察哮喘和过敏性肺炎 ( HP)患者肺泡巨噬细胞 ( AM)释放白细胞介素 - 12 ( IL - 12 )能力的差异并探讨其意义。方法 :对哮喘及 PH患者各 10例进行支气管肺泡灌洗 ( BAL)获取 AM,经脂多糖刺激培养后取上清液用双抗体夹心酶联免疫吸附法 ( EL ISA)测量 IL- 12含量 ,并与 10例健康者作对照。结果 :哮喘组 IL- 12水平不但低于 HP组也低于对照组( P均 <0 .0 1) ;HP组 IL - 12水平不但高于哮喘组也高于对照组 ( P <0 .0 1)。结论 :IL - 12水平的改变在哮喘及

抗原致敏树突状细胞抗小鼠白念珠菌系统感染的实验研究

目的研究不同形态白念珠菌致敏的小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)对免疫抑制小鼠白念珠菌系统感染的免疫保护作用及所对应的细胞因子改变。方法孢子相和菌丝相白念珠菌在体外分别致敏小鼠骨髓来源的DC(BM-DC),测定混合培养上清IL-12水平;尾静脉回输免疫抑制小鼠体内后,ELISA法测定各组小鼠脾IFN-γ及IL-4水平,并检测肾携菌量。结果DC孢子致敏组上清IL-12水平(380.2±104.13)pg/mL明显高于DC菌丝致敏组和对照组(P<0.05);而DC菌丝致敏组(74.79±23.47)pg/mL与单纯DC培养组上清IL-12水平(19.71±9.21)pg/mL差异无统计学意义(P>0.05)。孢子致敏DC、菌丝致敏DC分别过继免疫小鼠后,前者脾脏IFN-γ水平(269.43±17.34)pg/g明显高于其他组(P<0.05),IL-4水平(6.23±0.37)pg/g则明显低于其他对照组(P<0.05);荷菌一周后孢子致敏DC回输组小鼠肾携菌量(3.58±2.32)×102CFUs与健康小鼠荷菌组比较无统计学意义(P>0.05);其他各组间肾携菌量比较则有统计学意义(P<0.05)。结论尾静脉回输白念珠菌孢子体外致敏的小鼠骨髓来源DC可有效诱导免疫抑制小鼠抗白念珠菌保护性免疫。

Adv-mIL-12转染KC治疗人结直肠癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的探讨Adv-mIL-12转染KC对人结直肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法用人结直肠癌细胞株LoVo建立裸鼠皮下移植瘤模型。五组分别注射NS、Adv-mIL-12、KC、KC-Adv-EGFP及KC-Adv-mIL-12。观察肿瘤生长曲线,脾脏指数(SI),肿瘤组织HE染色,免疫组化检测PCNA、CD34;观察肿瘤细胞增殖情况及微血管密度(MVD)。结果实验组(KC-Adv-mIL-12)瘤体平均体积367.78 mm3,对照组(NS)平均体积676.37 mm3,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组SI较对照组增加明显;HE染色提示实验组肿瘤细胞异型性减少、有明显的淋巴细胞浸润。肿瘤组织免疫组化提示:实验组PCNA阳性细胞比率较对照组明显减少(P<0.05),CD34染色标记测定MVD较对照组相比也呈下降趋势。结论 Adv-mIL-12转染KC能有效地抑制裸鼠人结直肠癌移植瘤生长、阻止瘤体微转移,并能提高机体免疫力。

鼠巨细胞病毒感染对小鼠脾细胞IL-12 p35和p40基因转录和表达的影响

目的探讨鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对小鼠脾细胞内TH1细胞调控因子白细胞介素-12(IL-12)p35和p40基因转录和表达影响的时序性变化特点。方法制备全身播散型MCMV感染小鼠模型,于感染后3 d、5 d、7 d、10 d和14 d分离小鼠脾细胞,在PHA刺激后用RT-PCR法检测脾细胞内IL-12 p35和p40 mRNA水平时序性变化,ELISA法测定脾细胞培养上清中IL-12 p70和IFN-γ蛋白水平变化。结果模型鼠在感染后第3天IL-12 p70表达显著增高(P<0．05),但第5天后急剧下降,显著低于正常鼠(P<0．05);IFN-γ在感染后第3天增高达峰值(P<0．01),随后逐渐下降,在感染后第10-14天降至正常水平;IL-12 p35 mRNA水平变化与IL-12 p70完全一致;而p40 mRNA则从感染第3天开始持续高水平表达(P<0．01)。结论IL-12 p35 mRNA和IL-12 p70在感染5 d后持续明显下降是感染后期TH1类细胞因子持续低表达、TH1反应受抑制的主要原因之一;感染后IL-12 p40 mRNA持续高水平可能导致拮抗剂(p40)2表达增加,后者可进一步抑制IL-12功能。

白介素12B基因rs6887695多态性与汉族人寻常性银屑病临床表型的相关性

目的探讨白介素12B（IL-12B）基因多态性位点rs6887695与汉族人寻常性银屑病临床表型（发病年龄、家族史、临床类型、性别）的相关性。方法采用ABITaqman探针荧光PCR技术，对575例寻常性银屑病患者和1403例健康对照的DNA样本进行IL-2B基因多态位点rs6887695的基因分型。使用SPSS14．0分析软件，妒检验比较患者组和健康对照组间、不同临床表型组间的基因型和等位基因频率分布的差异性。结果IL-12B基因多态性位点rs6887695三种基因型（GG、GC、CC）频率在寻常性银屑病患者组分别为42．61％、45．39％和12．0％，健康对照组分别为34．42％、47．83％和17．75％；等位基因频率（G、C）患者组分别为65．30％和34．70％，健康对照组分别为58．34％和41．66％，基因型和等位基因频率分布在患者组和健康对照组间差异均有统计学意义（r值分别为16．31和16．54，P值均〈0．01），在慢性斑块状（543例）和急性滴状银屑病患者（32例）组间的差异均有统计学意义（r值分别为18．11和12．19，P值均〈0．01）。等位基因G和基因型GG在患者组中的频率明显高于健康对照组，等位基因G和基因型GG在斑块状患者中的频率高于滴状患者。少儿发病组（35例）与成人发病组（540例）、家族史阳性组（102例）与家族史阴性组（440例）、男性患者组（341例）与女性患者组（234例）的基因型和等位基因频率分布差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。结论IL-12B（rs6887695）基因多态性与汉族人寻常性银屑病易感性相关联，特别是与斑块状银屑病相关．但与患者的发病年龄、家族史及性别可能无关联。

急性辐射病小鼠应用白细胞介素12的防护研究

目的观察重组鼠白细胞介素12（rm IL-12）对急性辐射病小鼠的最佳防护剂量。方法 84只BALB/c小鼠均给予60Coγ射线6.0 Gy一次全身照射,随机分为照射对照组、rm IL-12 5、10、20、40、60μg/kg治疗组,治疗组分别于照后1 h及此后每3天一次分别腹腔注射5、10、20、40、60μg/（kg·d）的rm IL-12,共5次,每天2次观察小鼠一般情况,3天检测1次外周血细胞数,分别于照射后14天和28天收集骨髓细胞进行集落培养。结果 rm IL-12治疗组小鼠一般情况较对照组改善;血小板最低值高于对照组（13.9%～21.5%vs 8.1%,P﹤0.01）,恢复速度快于对照组,20μg/kg最佳;治疗组白细胞恢复速度快于对照组,20μg/kg最佳;治疗组血红蛋白最低值高于对照组（62.9%～68.3%vs 49.9%,P﹤0.01）;骨髓有核细胞集落培养示rm IL-12治疗组CFU-Mix明显高于对照组（P﹤0.01）;20μg/kg治疗组优于其他治疗组（P﹤0.05）。结论 rm IL-12 5、10、20、40、60μg/kg治疗均可明显促进急性放射病小鼠造血功能,尤其是巨核系的恢复,20μg/kg治疗最佳。

病毒性肝炎患者lL-12及STNFR的检测及临床意义

目的探讨病毒性肝炎患者血清中 IL-12与可溶性肿瘤坏死因子(sTNFR)的改变及其临床意义。方法双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测64例病毒性肝炎患者及20例正常对照血清 IL-12与sTNFR 水平。结果病毒性肝炎患者血清IL-12与 sFNFR 水平明显高于正常对照,与临床病型关系密切,在慢性肝炎、急性肝炎及重型肝炎依次升高,差异有显著性意义(P<0.01)。恢复期血清 IL-12水平迅速复常(P>0.05);血清 sTNFR 在急性肝炎恢复期,迅速复常(P>0.05),在慢性肝炎恢复期及部分重型肝炎恢复期血清 sTNFR 水平仍高于正常(P<0.05)。血清 IL-12与 sTNFR 水平与血清总胆红素及谷丙转氨酶水平呈正相关。结论检测血清 IL-12与 sTNFR 水平,可判断病情的严重程度及预后,指导临床诊断及治疗。