目的:探讨泛素链接酶LNX1(ligand of numb-protein X 1)对肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的分子作用机制。方法:利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库分析LNX1 mRNA...目的:探讨泛素链接酶LNX1(ligand of numb-protein X 1)对肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的分子作用机制。方法:利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库分析LNX1 mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达水平,及其与肾透明细胞癌患者预后的相关性。采用慢病毒感染的方法将携带特异性针对LNX1基因的shRNA(shLNX1)转入肾透明细胞癌细胞786-O和ACHN中;采用瞬时转染的方法将重组质粒flag-LNX1转入786-O和ACHN细胞中。分别采用CCK-8实验和细胞集落形成实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞增殖能力的影响,Transwell小室实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞侵袭和迁移能力的影响。采用生物信息学分析法筛选LNX1的下游靶基因,采用蛋白质印迹法检测沉默或过表达LNX1对T淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1,TIAM1)及其下游ERK信号通路中ERK及其磷酸化蛋白表达水平的影响。用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞,并且蛋白质印迹法检测TIAM1蛋白的表达水平。最后在过表达LNX1的细胞中同时转入重组载体myc-TIAM1,再用蛋白质印迹法、细胞集落形成实验和Transwell小室实验检测ERK信号通路中各蛋白的表达水平,以及同时过表达LNX1和TIAM1对786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:肾透明细胞癌组织中LNX1 mRNA的表达水平降低(P<0.05),其表达水平与患者的生存时间呈正相关(P<0.001)。成功构建沉默LNX1基因的786-O和ACHN细胞,以及过表达LNX1的786-O和ACHN细胞。沉默LNX1基因后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增强(P均<0.05);过表达LNX1后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱(P均<0.05)。生物信息学分析发现TIAM1为LNX1的潜在靶蛋白。沉默LNX1基因后,TIAM1和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)蛋白的表达水平明显升高(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变;过表达LNX1后,TIAM1和磷酸化ERK蛋白的表达水平明显降低(P均<0.01),而ERK蛋白的表达水平未发生变化。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞后,TIAM1蛋白的表达水平升高(P<0.01和P<0.001)。在过表达LNX1的细胞中转入myc-TIAM1质粒后,p-ERK蛋白的表达水平升高,细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变。结论:LNX1通过降解TIAM1,进而调节ERK的磷酸化,最终抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。展开更多
文摘目的:探讨泛素链接酶LNX1(ligand of numb-protein X 1)对肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的分子作用机制。方法:利用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库分析LNX1 mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达水平,及其与肾透明细胞癌患者预后的相关性。采用慢病毒感染的方法将携带特异性针对LNX1基因的shRNA(shLNX1)转入肾透明细胞癌细胞786-O和ACHN中;采用瞬时转染的方法将重组质粒flag-LNX1转入786-O和ACHN细胞中。分别采用CCK-8实验和细胞集落形成实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞增殖能力的影响,Transwell小室实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞侵袭和迁移能力的影响。采用生物信息学分析法筛选LNX1的下游靶基因,采用蛋白质印迹法检测沉默或过表达LNX1对T淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1,TIAM1)及其下游ERK信号通路中ERK及其磷酸化蛋白表达水平的影响。用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞,并且蛋白质印迹法检测TIAM1蛋白的表达水平。最后在过表达LNX1的细胞中同时转入重组载体myc-TIAM1,再用蛋白质印迹法、细胞集落形成实验和Transwell小室实验检测ERK信号通路中各蛋白的表达水平,以及同时过表达LNX1和TIAM1对786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:肾透明细胞癌组织中LNX1 mRNA的表达水平降低(P<0.05),其表达水平与患者的生存时间呈正相关(P<0.001)。成功构建沉默LNX1基因的786-O和ACHN细胞,以及过表达LNX1的786-O和ACHN细胞。沉默LNX1基因后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增强(P均<0.05);过表达LNX1后,786-O和ACHN细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱(P均<0.05)。生物信息学分析发现TIAM1为LNX1的潜在靶蛋白。沉默LNX1基因后,TIAM1和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)蛋白的表达水平明显升高(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变;过表达LNX1后,TIAM1和磷酸化ERK蛋白的表达水平明显降低(P均<0.01),而ERK蛋白的表达水平未发生变化。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理过表达LNX1的786-O和ACHN细胞后,TIAM1蛋白的表达水平升高(P<0.01和P<0.001)。在过表达LNX1的细胞中转入myc-TIAM1质粒后,p-ERK蛋白的表达水平升高,细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强(P均<0.05),而ERK蛋白的表达水平不变。结论:LNX1通过降解TIAM1,进而调节ERK的磷酸化,最终抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
