杂交3倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究

通过天然4倍体(4n=100)和2倍体(2n=50)泥鳅杂交创制不同子代杂交组合(4n♀×2n♂、2n♀×4n♂)。以传代20次的杂交3倍体泥鳅鳍细胞系为材料,采用常规冷滴片法制备染色体标本,通过吉姆萨染色确定数目及核型;通过银染法及CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色技术对其进行带型分析。结果显示:正反交3倍体鳍细胞系的染色体分裂相数目为3n=75,核型公式15m+6sm+54t,NF=96;正反交3倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分裂相中显示有3个银染点,均位于第1组中部着丝粒染色体(M1)短臂的端部区域;正反交3倍体泥鳅鳍细胞的染色体中期分裂相中显示有3个CMA_3荧光信号点,均位于M1区域。研究表明:杂交3倍体泥鳅鳍细胞经细胞培养传代20次后的染色体组成未发生改变,其染色体数目、核型和带型与3倍体泥鳅其他体细胞结果一致。

重铬酸钾对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应

以二倍体和三倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系(DIMF和TRMF)为实验材料,研究了重铬酸钾对细胞的氧化损伤、微核形成以及金属硫蛋白表达情况的影响,旨在多角度探讨重铬酸钾对细胞系的毒性效应,建立适合监测其污染情况的指标。采用MTT法测定了细胞的半数抑制浓度;使用试剂盒测定了3种主要抗氧化酶活性;吉姆萨染色后观察了细胞微核的变化,并通过实时定量PCR方法测定了金属硫蛋白的表达情况。结果表明,24 h急性毒性实验两种细胞系的半抑制浓度分别为(25.3±1.2)μmol/L、(27.9±0.6)μmol/L,DIMF对重铬酸钾的敏感性要高于TRMF。当重铬酸钾浓度为0~30μmol/L时,二个细胞系的超氧化物歧化酶(SOD)活性随染毒浓度升高而升高。当重铬酸钾浓度为0~20μmol/L时,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性逐渐升高,浓度为30~40μmol/L时,其活力开始下降。两种细胞系的谷胱甘肽S转移酶(GST)活性随重铬酸钾浓度增大逐渐降低。二倍体细胞系氧化酶活性均低于三倍体。微核试验显示,重铬酸钾可引起细胞核损伤,形成微核。当重铬酸钾浓度为40μmol/L时,DIMF、TRMF微核率达到最大,分别为7.33‰和8.00‰,DIMF微核率要低于TRMF。实时定量PCR结果显示,对照组金属硫蛋白(MT)基因表达量很低,但经重铬酸钾胁迫后,MT基因表达量显著升高(P<0.01)。

铜、锌对泥鳅细胞DNA损伤及金属硫蛋白表达的影响

采用0、100、200、400、800μmol/L的硫酸铜和0、200、400、800、1600μmol/L的氯化锌分别处理泥鳅鳍细胞系,培养24 h后,用单细胞凝胶电泳检测其DNA损伤情况,同时对金属硫蛋白基因的表达进行研究。试验结果表明,随着两种重金属浓度的增加,泥鳅鳍细胞的DNA损伤程度呈现明显的剂量依赖性。当硫酸铜浓度≥200μmol/L、氯化锌浓度≥400μmol/L时,细胞的拖尾率、彗尾DNA比例、彗星尾长、彗星尾距和Olive尾矩均显著增大(P<0.05)。泥鳅细胞金属硫蛋白基因的表达量随着硫酸铜浓度的升高呈现出短暂稳定后显著下降的趋势,而随着氯化锌浓度的增大呈现出显著上升再显著下降的趋势,表明氯化锌浓度≤400μmol/L时可显著诱导泥鳅鳍细胞系金属硫蛋白的转录表达。综合来看,与锌相比,泥鳅鳍细胞对铜的解毒能力和耐受力更差。因此,铜污染对泥鳅细胞的遗传毒性更加明显。本研究将为探讨重金属对生物的毒性效应及生物学监测提供理论依据。

杀虫单对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性作用

以泥鳅鳍二倍体(DIMF)和三倍体(TRMF)细胞系为受试细胞,研究杀虫单对2种细胞系的毒性作用。采用噻唑蓝(MTT)法测得DIMF与TRMF 24 h半致死浓度分别为119.73 mg·L-1、146.26 mg·L^(-1)。DIMF的敏感性明显高于TRMF。经杀虫单处理的活体细胞表现为细胞伸长,空泡化和脱落并游离于培养基表面的现象。2种细胞系酶活力测定的结果显示:杀虫单浓度为0~100 mg·L^(-1)时,SOD和GST活力随着浓度的增加而增加,100~200 mg·L^(-1)浓度组酶活力逐渐降低;0~200 mg·L^(-1)时,ACh E活力与杀虫单浓度呈负相关,并且三倍体3种酶活力均高于二倍体。微核试验结果显示:50 mg·L^(-1)杀虫单就能对细胞核造成损伤并形成微核,微核率随杀虫单浓度增加而增加。当杀虫单浓度达到200 mg·L-1时,微核率出现最大值,DIMF和TRMF分别为3.3‰和3.7‰,2种细胞的测试结果无显著性差异(P>0.05)。电镜观察结果显示:对照组DIMF和TRMF超微结构无明显差异;DIMF和TRMF病理变化情况相似:染色质凝集趋边,细胞核分解成多个,细胞内出现空泡和凋亡小体,表现出凋亡的特征。研究表明杀虫单的细胞毒性机制是通过改变细胞内酶活性从而诱导凋亡,不同倍性细胞系之间的差异主要与多倍体细胞体积大,胞内物质多,分裂快,生长旺盛等有关。